Chemokin-Rezeptor-Modulation während der T-Zell-Aktivierung: Untersuchung zur Funktion der GTPase Ras
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- Frieder Althaus
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1 Aus dem Institut für Immunologie der Universität Heidelberg Geschäftsführender Direktor: Herr Prof. Dr. med. Stefan Meuer Chemokin-Rezeptor-Modulation während der T-Zell-Aktivierung: Untersuchung zur Funktion der GTPase Ras Inauguraldissertation zur Erlangung des medizinischen Doktorgrades an der Medizinischen Fakultät Heidelberg der Ruprecht-Karls-Universität Is o der mündffchen Prüfung: vorgelegt von - 4. JULI 2016 Anja Neßmann aus Karl-Marx-Stadt, jetzt Chemnitz 2015
2 Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Einleitung T-Zell-vermittelte Immunantwort CD4-T-Zellen (T-Helfer-Zellen) CD8-T-Zellen (Zytotoxische T-Zellen) T-Gedächtniszellen Chemokin-vermittelte Wanderung von T-Zellen Chemokine Chemokinrezeptoren Rolle der Chemokine für die Wanderung von T-Zellen T-Zell-Aktivierung und Kostimulation Durch den T-Zell-Rezeptor ausgelöste Signale und die Aktivierung der GTPase Ras Die GTPase R a s Aktivierung durch Signaltransduktion Mutationen des (H)Ras im Rahmen der Tumorentwicklung Zielsetzung der experimentellen Arbeit Material und Methoden Material Zellen cdna-konstrukte Antikörper und Fluoreszenzfarbstoffe Medien für die Zellkultur Puffer und Reagenzien Chemikalien und Materialien G eräte Labor- und Verbrauchsmaterialien Software und Datenbanken...21
3 2.2 Methoden Isolierung von humanen Pan-T-Zellen mit dem Pan-T-Zell-Isolations-Kit II von Miltenyi Transfektion von cdna Inhibierung von Ras-Effektoren nach Transfektion primärer humaner T-Zellen mit V12-R as Kostimulation von T-Zellen über Platten-gebundene Antikörper Stimulation von T-Zellen mit Superantigen-beladenen Raji-B-Zellen durch direkten Kontakt Stimulation primärer humaner T-Zellen mit lonomycin und PMA Immunfluoreszenzfärbung von T-Zellen für die Durchflusszytometrie Intrazelluläre Immunfluoreszenzfärbung von T-Zellen für die ometrie und die Multispektrale Bild-Durchflusszytometrie (M IFC) Transwell-Chemotaxis-Assay mit transfizierten humanen T-Zellen Auswertung der Durchflusszytometrie Statistik Ergebnisse Einfluss von lonomycin und PMA auf die Chemokinrezeptor- Oberflächenexpression humaner T-Zellen Einfluss von konstitutiv aktivem V12-Ras auf die Oberflächenexpression der Chemokinrezeptoren untransformierter humaner T-Zellen Funktionelle Auswirkung der Expression von konstitutiv aktivem V12-Ras auf die Chemotaxis untransformierter humaner T-Zellen Morphologieänderungen und Zellpolarisierung nach Expression von konstitutiv aktivem V12-Ras in untransformierten humanen peripheren T-Zellen Einfluss von konstitutiv aktivem V12-Ras auf die Oberflächenexpression der Chemokinrezeptoren auf Jurkat-T-Lymphom-Zellen Funktionelle Auswirkung von konstitutiv aktivem V12-Ras auf die Chemotaxis von Jurkat-T-Lymphom-Zellen...45
4 3.7 Chemokinrezeptorexpression nach Hemmung spezifischer Moleküle in der nachgeschalteten Signalkaskade von R as Auswirkungen von lonomycin/ PMA und V12-Ras auf die Zytokinproduktion von primären humanen T-Zellen Einfluss der Kombination von lonomycin/ PMA mit konstitutiv aktivem V12-Ras auf die Chemokinrezeptor-Oberflächenexpression humaner T-Zellen Untersuchungen der Oberflächenexpression von Chemokinrezeptoren auf T-Zellen nach Kontakt mit B-Zellen (als Antigen-präsentierende Zellen) Diskussion Einordnung der erworbenen Ergebnisse dieser Arbeit in Bezug auf bekannte Erkenntnisse Funktion der Chemokinrezeptorregulation Der Einfluss von Ras auf die Regulation der Oberflächenexpression der Chemokinrezeptoren Abhängigkeit der Chemotaxis und Migrationsfähigkeit von der Chemokinrezeptorexpression Polarisierung der T-Zelle durch konstitutiv aktives V I 2-Ras Einfluss von konstitutiv aktivem V I 2-Ras auf die Ober-flächenexpression der Chemokinrezeptoren in Jurkat-T-Zellen und dessen funktionelle Konsequenzen auf die Chemotaxis Zytokinproduktion durch Ras-Aktivierung Führt eine zusätzliche Stimulation zusammen mit konstitutiv aktivem Ras zur Aktivierung der T-Zelle? Chemokinrezeptormodulation im Zell-Zell-System Schlussfolgerung Zusammenfassung Literaturverzeichnis... 76
5 7. Eigene Veröffentlichung Lebenslauf Personalien Schulischer Werdegang Universitärer Werdegang Danksagung...101
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