Bioanalytik DNA-Microarray-Technologie. Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16

Transkript

1 Bioanalytik DNA-Microarray-Technologie Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16

2 Inhalt der Vorlesung Was sind DNA-Microarrays Einsatzmöglichkeiten für DNA-Microarrays Microarrays für die Expressionsanalyse SNP-Analyse mit Microarrays Untersuchung der RNA-Reifung mit Microarrays Sonden und deren Fixierung an den Träger Detektion Problematik, Reproduzierbarkeit,... Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 2

3 Was sind DNA-Microarrays? DNA-Microarrays auch DNA-Chips genannt: Auf einem festen Trägermaterial rasterförmig angeordnete DNA-Moleküle. Je nach Sondenanzahl auf dem Träger unterscheidet man low density chips ( Spots/cm 2 ) und high density chips (> Spots/cm 2 ). Jeder Spot beinhaltet ein identisches DNA-Molekül als Sonde, das in millionenfacher Kopienzahl vorliegt und ein spezifisches Gen repräsentiert. Das methodische Herz von Microarrays ist die DNA-Hybridisierung! Microarrays ermöglichen die parallele Analyse tausender Gene. Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 Bildquelle: Wünschiers R. et al. (2001): Herstellung und Verwendung von DNA- Microarrays. CLB Chemie in Labor und Biotechnik, 52. Jahrgang, Heft 7/2001,

4 Anwendungsfelder für DNA-Microarrays Eins der populärsten Anwendungen: Bestimmung der Genexpression! z.b. Untersuchung der Transkriptmenge in Zellen, die bei unterschiedlichen Bedingungen kultiviert wurde (Stress keine Stress) z.b. Untersuchung der Transkriptmenge von Zellen aus Tumorgewebe und normalem Gewebe Identifizierung von Einzelbasenaustauschen (single nucleotide polymorphism, SNP) für diagnostische Anwendungen Epigenetische Studien DNA-Kopienzahl Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 4

5 Der Workflow Ergebnis Analyse Hybridisierung Detektion Spotting Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 5

6 Transkriptionsstudien mit Microarrays (transcriptional profiling) RNA aus zwei Geweben, z.b. Normal- und Tumorgewebe wird in cdna übersetzt und gleichzeitig mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert Der DNA-Chip trägt pro Spot verschiedene DNA- Sonden, die alle Gene repräsentieren. Die markierte cdna (roten und grünen) binden an die entsprechenden Sondenmoleküle in den Spots. Ist die Transkriptmenge in beiden Geweben gleich, dann ensteht in den Spots die Mischfarbe gelb. Überwiegt die Transkriptmenge in einem der beiden Gewebetypen, dann erscheint der Spot grün oder rot. Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 6

7 Micorarray-basierte SNP-Analyse (Genotypisierung) Single Nucleotide Polymorphism (SNP) = Identifizierung von Einzelbasenaustauschen Bei einer Sondenlänge von 20 bp sollte ein einzelner Basenaustausch die Hybridisierung mit dem komplementären Strang verhindern. Anwendung: z.b. zum Nachweis von Mikroorganismen im Gesundheitswesen, in der Nahrungsmittelkontrolle, Abwasserwirtschaft Zum Feststellen genetischer Abnormalitäten bei Krebs z.b. loss of heterozygosity (LOH) Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 7

8 Micorarray-basierte SNP-Analyse gekoppelt mir einer Polymerasereaktion SNP-Analyse durch Polymerasereaktion Es werden chipgebundene Oligonukleotide benutzt, die genau bis vor die zu untersuchende Base reichen. Entweder es werden verschiedenfarbig markierte Desoxynucleotide verwendet, dann reicht eine Sequenzvariante auf dem Träger Es wird nur ein farbmarkiertes Nukleotid eingesetzt und alle Sequenzvarianten sind auf dem Chip. Es leuchtet nur der Punkt, bei dem die komplementäre Base passte Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 8

9 Sondensynthese allgemein Als Sonden werden prinzipiell verwendet: Oligonucleotide (r.d.r nt), cdna oder PCR-Produkte ( nt). Entweder werden die Sonden vorher synthetisiert und dann auf den Glaträger aufgebracht (Spotted Microarray), oder direkt auf dem Glasträger synthetisiert (Oligonucleotide-Microarray) Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 9

10 Sondensynthese, photolitographisches Verfahren In-situ-Synthese von Oligonucleotiden auf der Chipoberfläche Dafür sind photolabile Schutzgruppen erforderlich Sequentielles Aufbringen unterschiedlicher Lochmasken, um nicht an alle Enden die gleiche Base zu hängen Synthese von Oligonucleotiden mit einer Länge von bp bis zu 106 Oligonucleotide pro cm 2 Beschränkung: Länge der Oligonucleotide Hohe Kopplungseffizienz nötig, da anonsten die Sonden nicht der gewünschten Sequenz entsprechen Hoher Anteil an nicht erwünschten Abbruchprodukten setzt die Qualität bei den nachfogenden Hybridisierungsexperimenten herab. Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 10

11 Sondensynthese, photolitographisches Verfahren Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 11

12 Transfer der DNA auf den Bio-Chip: Spotting Verfahren In Pufferlösung vorliegende DNA-Sonden werden in durch Nadeln oder Kapillaren aufgenommen und an einer definierten Position des aktivierten Trägers wieder abgegeben. Das transferierte Probenvolumen und damit die Größe des resultierenden Spots wird durch die Geometrie und Beschaffenheit der Nadel bestimmt. Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 12

13 Transfer der DNA auf den Bio-Chip: Injet-Verfahren Beim In-Jet-Verfahren wird die Flüssigkeit aktiv aufgenommen und mittels eines Piezoelements abgegeben. Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 13

14 Transfer der DNA auf das Trägermaterial: Bildgallerie Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 14

15 Immobilisierung von DNA-Sonden auf der Matrix Aufbringen von Oligonucleotiden, cdna oder PCR-Produkten an einer aktivierten Trägeroberfläche durch Spotting-Verfahren oder piezoelektrischen Transfer Apparative weniger aufwendig, flexibler als das in-situ Verfahren Sonden können vorher aufgereinigt werden > höhere Spezifität der Hybridisierung Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 15

16 Hybridisierung Automatisierter Hybridisierung im Hybridisierstation gewährleistet gleichbleibende Temperatur, Salzkonzentration, Luftfeuchtigkeit, ph-wert und die Verwendung organischer Lösungsmittel. Automatisiertes Hybridisieren & Waschen Automatisierte Temperatur-Kontrolle Simultane Prozessierung von bis zu 12 Chips i.d.r. Hybridisierung bei 40 C über Nacht mit 5xSSC, 50%Formamid Stringentes Waschen, z.b. 30 C, 60s, 2xSSC, 0.1%SDS Stringenz spielt auch hier eine Rolle! Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 16

17 Detektion Laseranregung: 532nm Nd:YAG / 633nm HeNe Laser (Leistung regelbar) oder Weißlicht-Quelle mit Filtersystem nächste Folie Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 17

18 Datenanalyse Problematische Spots: Trends in Biotech Hess et al, 19(11),2001 Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 18

19 Auswertung der Daten Normalisierung rot: gemessene Werte blau: normalisierte Werte Im Idealfall sollten die Mehrheit der Datenpunkte auf der Winkelhalbierenden des Plots liegen, weil die meisten Gene gleich stark exprimiert werden. Für die Normalisierung wird eine Konstante c zu den Intensitäten des roten Kanals (Cy5) addiert, weil dieser schwächer emittiert als die grünen Signale Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 19

20 Auswertung der Daten: Kontrollexperiment RNA wird geteilt: eine Hälfte wird mit Cy3 markiert, die andere Hälfte mit Cy5 >99% der Punkte liegen innerhalb der Grenzen für 2-fach Regulation Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 20

21 Auswertung der Daten Normale Lunge: RNA Cy5-markiert Lungentumor: RNA Cy3-markiert Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 21

22 Auswertung der Daten Normale Lunge: RNA Cy5-markiert Lungentumor: RNA Cy3-markiert Herunter-reguliert Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 22

23 Warum messen wir die Transkription von Genen? DNA mrna Protein Metabolit Phänotyp Transkription Translation Annahmen: stärker exprimierte Gene sind wichtiger Genepression korrespodiert mit Proteinmenge Normale Zellen haben ein Standard-Expressionsprofil Veränderungen im Expressionsprofil deuten an, dass etwas passiert Genexpressionsprofile gewähren einen Einblick in den Metabolismus der Zelle oder auf Aktivitäten auf molekularem Level Realität: In vielen Fällen korrespondiert die Menge an mrna nicht mit der Menge an Protein. Vorsicht bei der Interpretation von Ergebnissen! Beachte: Daten müssen in unabhängigen Experimenten reproduziert worden sein! Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 23