Elektrophorese. Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien

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1 Elektrophorese Die SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese ist eine schnelle und empfindliche Methode, die zudem eine hohe Auflösung erlaubt. Schon 1 μg (2 pmol) eines Proteins ergeben eine erkennbare Bande. Proteine deren Masse sich um 2% unterscheiden (z.b. 40 bzw. 41 kd betragen, was einer Differenz von etwa 10 Aminosäureresten entspricht), lassen sich noch trennen. Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien

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12 Gelektrophorese Gelelektrophorese ist eine analytische Methode der Chemie und Molekularbiologie, um verschiedene Arten von Molekülen zu trennen. Dabei wandert eine Mischung aus zu trennenden Molekülen unter Einfluss eines elektrischen Felds durch ein Gel, welches in einer ionischen Pufferlösung liegt. Je nach Größe und Ladung der Moleküle bewegen sich diese unterschiedlich schnell durch das als Molekularsieb wirkende Gel. Dabei wandern kleine, negativ geladene Moleküle (Anionen) am schnellsten in Richtung der positiv geladenen Anode und positiv geladene Moleküle (Kationen) in Richtung der negativ geladenen Kathode. Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien

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14 Die Moleküle des Gels, beispielsweise Agarose oder polymerisiertes Acrylamid, bilden ein engmaschiges Netzwerk, das die zu trennenden Moleküle bei ihrer Wanderung im elektrischen Feld behindert. Agarose-Gele sind relativ großporig (150 nm bei 1%igen, 500 nm bei 0,16%igen Gelen) und eignen sich gut zur Trennung von DNA und hochmolekularen Proteinen. Polyacrylamid-Gele weisen wesentlich kleinere Poren auf (3-6 nm). Die Porengröße hängt von der Acrylamidkonzentration und dem Vernetzungsgrad ab. Je nach Anwendung werden dem Gel verschiedene Zusatzstoffe zugesetzt, beispielsweise SDS bei der SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) oder Ampholyte bei der Isoelektrischen Fokussierung (IEF). Gele können ohne großen Aufwand selbst hergestellt werden. Fertige Gele und die entsprechenden Puffersysteme können zudem kommerziell erworben werden. Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien

15 Agarose ist ein Polysaccharid, aus D-Galaktose und 3,6-Anhydrogalactose, die glycosidisch verbunden sind. Es stellt die Hauptkomponente des Agars dar und wird vor allem aus den Rotalgengattungen Gelidium und Gracillaria gewonnen. Agarose ist ein starker Gelbildner und für die Gelierfähigkeit des Agars verantwortlich. Agarosegel ist die Bezeichnung für ein Gel, das in der Agarose- Gelelektrophorese zur elektropherographischen Trennung von Substanzen, z. B. von Nukleinsäuren oder Proteinen eingesetzt wird. Es wird durch Aufkochen von Agarose in einem Puffer, beispielsweise TBE-Puffer, hergestellt. Die Konzentration der Agarose im Puffer richtet sich nach der Größe der mit der Gelelektrophorese aufzutrennenden Teilchen, wobei für kleinere Partikel eine bessere Trennung (räumliche Auflösung) mit einem höherprozentig angesetzten Agarosegel erzielt werden kann, für größere mit einem niederprozentigen Gel. Für die Agarosegel-Elektrophorese von Plasmiden und deren Restriktionsfragmente verwendet man beispielsweise meist eine Konzentration von 0,7 bis 1,2 % Agarose im Gelpuffer. Für die Auftrennung von RNA muss man spezielle Formaldehyd-haltige Gele verwendet werden. Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien

16 Für die Agarose-Gelelektrophorese werden benötigt: Die DNA, die nach ihrer Größe aufzutrennen ist. Eine DNA-Leiter, eine Mischung verschiedener DNA- Stränge bekannter Länge, mit der die DNA-Probe verglichen werden kann, um deren Größe zu bestimmen. DNA-Leitern sind kommerziell erhältlich. TBE-Puffer, ph 8,0 Agarose Ethidiumbromid (5 mg/ml in Wasser) oder anderer Nukleinsäure-Farbstoff Ein Farbmarker, z. B. ein niedermolekularer Farbstoff wie Bromphenolblau, um den Fortschritt der Elektrophorese abschätzen zu können. Eine Elektrophoresekammer aus Plexiglas. Ein "Kamm" (normalerweise aus Plexiglas oder Teflon). Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien

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18 Proteine kann man vor der Elektrophorese mit denaturierenden, ionischen Detergentien wie Natriumdodecylsulfat (SDS) behandeln. Man spricht dann von SDS-PAGE. Dabei binden die meisten Proteine eine konstante Menge SDS (1 Molekül SDS pro 3 Aminosäuren), dadurch haben alle Proteine ein konstantes Ladungs/ Gewichts-Verhältnis. Sie erfahren also im elektrischen Feld alle die gleiche Beschleunigung, werden aber vom Gel größenabhängig gebremst. Insgesamt erfolgt die Trennung also nach Molekülradius (nicht nach Molekulargewicht). Die Wanderungsgeschwin-digkeit wird durch die Ferguson-Gleichung beschrieben: log(m) = log(m0) KR * T wobei T die Gelkonzentration ist und M0 und KR Regressionsparameter. Diese Gleichung ermöglicht die Bestimmung des Molekülradius durch den Vergleich der elektrophoretischen Beweglichkeit mit der von Standardproteinen. Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien

19 Die klassische Gelelektrophorese wird als Zonenelektrophorese durchgeführt. Bei der Gelelektrophorese entsteht Wärme. Diese muss abgeführt werden, um optimale Bedingungen zu gewährleisten. Deswegen sollte die Gelelektrophorese in gekühlten Apparaturen bei konstanten Temperaturen durchgeführt werden, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Im Idealfall wird die Elektrophorese beendet, wenn die kleinsten beziehungsweise mobilsten Moleküle das Ende des Gels erreicht haben. Das garantiert die höchstmögliche Auftrennung der Moleküle... Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien

20 Die Zonenelektrophorese ist eine Trennung von amphoteren und nicht-amphoteren Stoffen in einem homogenen (einheitlichen) Puffersystem mit konstantem ph-wert durch ein elektrisches Feld. Die Trennung erfolgt nach der elektrophoretischen Mobilität (Beweglichkeit, Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld). Die zurückgelegte Strecke im Trennmedium innerhalb eines definierten Zeitraumes ist ein Maß für diese Mobilität. Die Mobilität der Analyten ist somit abhängig von Art und Höhe der Ladung, Radius und mitunter der Struktur. Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien

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24 DNA-Leiter und -Proben mit einer Pipette in jeweils eine Tasche spritzen (je nach Größe der Taschen von 2 µl bis zu 100 µl). Konstante Elektrische Spannung nach Länge der Elektrophoresekammer anlegen (5 Volt/cm); d.h. bei 20 cm Länge eine Spannung von 100 V. Elektrophorese beenden, wenn die DNA- Fragmente genügend aufgetrennt sind, Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien

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26 Zur Auswertung des Gels nach der Elektrophorese werden die zu trennenden Moleküle entweder vor der Elektrophorese radioaktiv markiert und anschließend in einer Autoradiographie nachgewiesen oder nach der Elektrophorese mit verschiedenen Farbstoffen wie beispielsweise Ethidiumbromid "gefärbt" und unter UV-Licht betrachtet. So verfährt man etwa mit DNA-Fragmenten. Proteine können angefärbt werden (siehe dazu: Färbung nach Fairbanks, Silberfärbung) Gleiche Moleküle laufen in diskreten Zonen - umgangssprachlich als Banden bezeichnet - durch das Gel. Mehrere Proben können parallel nebeneinander gleichzeitig durch dasselbe Gel laufen. Ist die Größe einiger Moleküle bekannt, kann man durch Vergleich von deren Banden mit den restlichen Banden die Größe der anderen Moleküle abschätzen. Solche Molekulargewichtsstandards sind kommerziell erhältlich. Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien

27 Eine Bestimmung der Menge einer Substanz in einer Bande beziehungsweise der relative Anteil einer Bande (siehe: Quantifizierung) ist nach der Färbung des Gels und einer anschließenden densitometrischen Auswertung möglich. Zur Bestimmung der Messwerte eines Geles wie z.b. Laufweiten, MW Gewichte, Quantifizierungen oder Normalisierung wird in den meisten Fällen eine Auswertesoftware genutzt. Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien

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36 Photo zur Dokumentation EtBr-gefärbte DNA Banden fluoreszieren im UV-Licht Banden können aus Gel ausgeschnitten Und die DNA daraus isoliert werden Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien

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38 Ein Western Blot (syn: Immunoblot) bezeichnet den Transfer von Proteinen auf eine Trägermembran, welche anschließend über unterschiedliche Reaktionen nachgewiesen werden können. Der Transfer kann dabei auf unterschiedliche Weise durchgeführt werden mittels Diffusionsblotting, Kapillarblotting oder Elektroblotting. Anwendung findet der Western Blot in der molekularbiologischen und medizinischen Forschung sowie in der Diagnostik. Die Bezeichnung des Blot-Verfahrens kommt vom Englischen "blot" "Klecks, Fleck" und dem "blotting paper" = Löschpapier, bei dem auch ein identischer Abdruck des Originals entsteht. Der Name Western Blot geht auf den Namen des Erfinders der Blotting Technik namens Edwin Southern zurück, der 1975 die Methode für die Auftrennung von DNA- Fragmenten und nachfolgender Hybridisierung als Southern Blot eingeführt hat. In Anlehnung an seinen Namen wurde die entsprechende Auftrennung von RNA-Fragmenten Northern Blot und das Proteinblotting als Western Blot bezeichnet. Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien

39 Vor dem eigentlichen Western Blot wird ein Proteingemisch mit Hilfe einer Gel- Elektrophoresetechnik in einer Trägermatrix entsprechend ihrer Größe, Ladung oder anderen Eigenschaften aufgetrennt. Hierbei werden die zu untersuchenden Proteine zuerst mit einem Gel in einzelne Proteinbanden aufgetrennt. Anschließend werden die Proteine beim Bloten vom Polyacrylamid-Gel durch ein senkrecht zum Gel angelegtes elektrisches Feld eluiert und auf eine Membran z.b. Nylon transferiert. An der Membranoberfläche bleiben diese aufgrund hydrophober Wechselwirkungen haften. Dabei bleibt das Muster der elektrophoretischen Auftrennung erhalten. Bei diesem Vorgang wird das an den Proteinen angelagerte SDS ausgewaschen. Daher können die Proteine renaturieren und teilweise ihre Sekundär- und Tertiärstruktur wieder einnehmen. Die Proteinbanden können nun auf der Membran mit Hilfe von spezifischen Antikörpern identifiziert werden. Spezifische Antikörper binden an der passenden Proteinbande auf der Membran. Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien

40 Southern Blot DNA geschnitten mit Restriktionsendonuklease Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien

41 Northern-Blot RNA RNA Marker RNA aus Gewebe isoliert Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien

42 Sichelzellanämie in homozygoten Personen in Malariagebieten in Afrika Sichelzellhämoglobin ist weniger löslich und formt Präzipitate Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien

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48 Herstellung einer 1% Agaroselösung in TBE; für kleine DNA-Fragmente bis zu 2%. Volumen ml, je nach Größe des Gels. Agaroselösung aufkochen bis die Agarose gelöst ist, normalerweise im Mikrowellenherd. Die Lösung bei Raumtemperatur bis auf ca. 60 C abkühlen lassen. 1 µl Ethidiumbromid pro 10 ml Gellösung dazugeben. Vorsicht: Ethidiumbromid ist mutagen! Die Gellösung mischen, bis sich das Ethidiumbromid gut verteilt hat, dann in die Gelkammer gießen. Den Kamm auf einer Seite des Gels hineinstecken, ca mm vom oberen Rand entfernt. Wenn das Gel fest geworden ist, den Kamm entfernen. Die Aussparungen, die im Gel zurückbleiben, werden als Taschen bezeichnet, diese sind vor Auftragen der Probe mit Puffer zu spülen. Das Gel in TBE-Laufpuffer legen. Das Gel muss vollständig bedeckt sein. Die Taschen müssen an der negativen Elektrode der Kammer zu liegen kommen. Den Probenpuffer mit Farbmarker zu den DNA-Proben hinzugeben. Die DNA- Leiter enthält für gewöhnlich schon Farbmarker. Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien

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