Nukleïnsäuren können lokalisiert werden und mit den morphologischen Veränderungen korreliert werden. fgf23 in embryonalen Knorpelzellen
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- Bärbel Hochberg
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Transkript
1 FISH in der Praxis
2 Nukleïnsäuren können lokalisiert werden und mit den morphologischen Veränderungen korreliert werden fgf23 in embryonalen Knorpelzellen
3 Detektion abnormer Gene Nachweis viraler DNA & RNA Phänotypisierung von Tumoren warum, Teil 2
4 Detektion abnormer Gene Anzahl Deletion Translokation Inversion
5 Detektion abnormer Gene normal Trisomie 12 Deletion p53 Inversion 16
6 virale Nukleïnsäuren HE HPV 16/18 p16ink4a
7 Tumore Diagnose IGH/MYEOV (CCND1)
8 Mantelzellymphom IGH/MYEOV (CCND1)
9 Mantelzellymphom Cyclin D1 IGH/MYEOV (CCND1)
10
11 del11q Tumore, Prognose
12 Tumore, Prognose
13 Prognose AML und MDS Typ der Chromosomenanomalie tritt auf bei Prognose t(8;21)(q22;q22) AML günstig t(15;17)(q22;q21) AML günstig inv(16)(p13q22),t(16;16)(p13;q22) AML/(MDS) günstig del(5q) MDS günstig Normal-Karyotyp (!) AML/MDS intermediär +8 AML/MDS intermediär t(9;11)(p21~22;q23) AML intermediär t/del(12p) AML/MDS intermediär/ungünstig der(1)t(1;7)(q10;p10) AML/(MDS) ungünstig inv(3)(q21q26), t(3;3)(q21;q26) AML/MDS ungünstig -5/del(5q) AML ungünstig t(6;9)(p23;q34) AML/MDS ungünstig -7/del(7q) AML/MDS ungünstig t(9;22)(q34;q11) AML/(MDS) ungünstig t/del(11q23) AML/(MDS) ungünstig komplex aberrant AML/MDS ungünstig (Fonatsch & Krömer: Myeloische Leukämien. Medgen, 14, , 2002)
14 ALK-EML4
15 Auswertung
16
17 DNA Sonden Herstellung: PCR in vitro DNA synthetisieren, Limit: erzielbare Länge der DNA Klonieren (Gensequenzen in lebende Bakterien/Hefen einschleusen und vermehren) durchflußzytometrische Isolierung ganzer Chromosomen, = Painting Proben Färbung: Direkter FISH: Fluorochrome enzymatisch direkt an die Nukleinsäuren koppeln Indirekter FISH: Reportermoleküle +fluoreszenzmarkierte Antikörper oder analog Immunhistochemie Vorteil der direkten FISH: mehrere Genabschnitte, unterschiedlich gefärbt, am selben Präparat einsetzbar
18 Pretreatment / Vorbehandlung Unterschiedliche Protokolle für unterschiedliches Material Metaphasenpräparate: Nachfixierung Methanol/Eisessig Dehydrierung Paraffinschnitte: Entparaffinisierung mit Xylol Zytologische Präparate: Fixierung Methanol/Eisessig Äquilibrierung in 2xSSC Pepsin-Andauung Nachfixierung in 1% Formaldehyd Dehydrierung Hochtemperatur-Demaskierungstechnik mit chaotropen Salzlösungen (80 C / Natriumthiocyanat) Äquilibrierung in 2xSSC Pepsin-Andauung Nachfixierung in 4% Formaldehyd Dehydrierung
19 Denaturierung / Hybridisierung / Detektion Unterschiedliche Protokolle für unterschiedliches Material Denaturierung (Einzelstränge) -Hitze/Formamid Hybridisierung Stringentes Waschen -Hitze, Detergenthältiger Puffer DAPI Gegenfärbung (0,15µg/ml) Mikroskopieren Filterausrüstung / Beurteilung
20 Fluoreszenz - Prinzip Bei der Absorption von Licht einer bestimmten Wellenlänge (=Anregungslicht) ist bei verschiedenen Molekülen eine gleichzeitige Emission von Licht mit größerer Wellenlänge beobachtbar (=Fluoreszenz) Sir George Gabriel Stokes, Dye Stokes-Regel : Absorption von kurzwelligem Licht, Emission von länger welligem Licht Stokes-Differenz : Differenz in der Wellenlänge zwischen Anregungslicht und emittierten Fluoreszenzlicht (meist 20 80nm) Excitation (Anregung) max (nm) Emission (Ausstrahlung) max (nm) DAPI Texas Red FITC
21 Filter Okular Sperrfilter (Barrier) Halogenlampe Filter ist nicht gleich Filter! mit eigenen Präparaten ausprobieren! Anregungsfilter (Exciter) Strahlteilender Spiegel Objektiv Objekt
22 Auszählkriterien Nur Kerne ohne Überlappung zählen Schichtdicke der Kerne beachten! (Ebenen) Kontrolle mit Einzelfarbfiltern Möglichst 200 Kerne zählen Möglichst von 2 Personen beurteilen lassen Nachweisgrenze Zentromersonden: min. 5% Locusspezifische Sonden: (Deletionen, Brüche) : min. 10%
23 Schichtdicke des Präparats, Einzelfarbfilter
24 Locus Spezifische Sonden 13q q34
25 Break Apart Sonden IGH IGH
26 Fusionssonden IGH CCND1
27
28 AML1 ETO CEP8
29 Risikoevaluierung MM (ASH 2010) CLL Hohes Risiko: del(17p13.1) t(14;16) t(14;20) del(17p13.1) del(11q22) del(6q23.3) Mittleres Risiko: t(4;14) Trisomie 12 Standard Risiko: t(11;14) t(6;14) del(13q14.3)
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