Entwicklung und Anwendungen der hochauflösenden STED-Mikroskopie

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1 Powered by Seiten-Adresse: Entwicklung und Anwendungen der hochauflösenden STED-Mikroskopie Aufgrund der Wellennatur des Lichts galt die durch die halbe Wellenlänge vorgegebene Auflösungsgrenze des Lichtmikroskops als unüberwindbar. Mit der Nobelpreis-gekrönten Erfindung der STED-Mikroskopie konnte Stefan Hell die Auflösung über diese Grenze hinweg um ein Vielfaches steigern. Die Entwicklung erlaubt Nanometer-genaue Einblicke in die Prozesse lebender Zellen und eröffnet neue Einsichten in die Wirkungsweise von Medikamenten. Stefan Hell vor seiner Formel der optischen Auflösungsgrenze. Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie Wenn der Physiker Stefan Hell am 10. Dezember 2014 aus der Hand des schwedischen Königs den Nobelpreis für Chemie entgegennimmt, wird ein Forscher geehrt, der - unbeeindruckt von den durch physikalische Gesetze festgelegten Grenzen - das Auflösungsvermögen der Lichtmikroskopie um gut das Zehnfache gesteigert und damit der direkten Beobachtung mikroskopischer Objekte ganz neue Dimensionen aufgestoßen hat (s. "Stefan Hell - Nobelpreis für einen Querdenker", Link oben rechts). Die Überwindung der Abbe-Grenze Ernst Abbe hatte 1873 in Jena die durch die Wellennatur des Lichtes vorgegebene Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie entdeckt. Sie besagt, dass zwei Punkte in der Bildebene nur dann optisch aufgelöst werden können, wenn sie mindestens etwa die halbe Wellenlänge 1

2 des Lichtes voneinander entfernt sind. Exakt formuliert lautet das Abbesche Gesetz, das in Stein gemeißelt auf dem Denkmal vor dem Physiologischen Institut der Universität Jena abgebildet ist: Δd = λ/(2n sin α), wobei λ die Wellenlänge des Lichtes, n der Brechungsindex der Probe und α der halbe Öffnungswinkel des gebündelten Lichtstrahls ist. Das Abbesche Gesetz, in Jena in Stein gemeißelt. Universität Jena Der am Brennpunkt entstehende Durchmesser des Lichtflecks kann danach nicht kleiner als der Abstand Δd sein. Sichtbares Licht hat Wellenlängen von Nanometer; Objekte, die in der Bildebene weniger als 200 bzw. 350 Nanometer voneinander entfernt sind, können demnach optisch nicht voneinander getrennt werden. Wesentlich schlechter ist die Auflösungsgrenze in der auf der Bildebene senkrecht stehenden Achse des Lichtstrahls. Durch die Verwendung von zwei Objektivlinsen in der sogenannten 4Pi-Mikroskopie war es Stefan Hell gelungen, einen in allen drei Dimensionen fast kugelförmigen Brennpunkt zu erzeugen und so die Auflösungsgrenze in der Strahlachse wesentlich zu verbessern. Doch der Beugungsgrenze selbst war das 4Pi-Mikroskop immer noch unterworfen. Dann, 120 Jahre nach Abbes Entdeckung, publizierte Hell - damals Postdoktorand an der Universität Turku in Finnland - ein neues physikalisches Konzept, mit dem die Beugungsgrenze radikal überwunden wird: die stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy (STED- Fluoreszenzmikroskopie). Inzwischen sind lichtmikroskopische Auflösungen bis hinunter zu etwa 20 Nanometern, das heißt in die Dimensionen einzelner Makromoleküle, möglich. Hell legte damit den Grundstein für die Nanoskopie und die NanoBiophotonik. Höchstauflösende Fluoreszenzmikroskopie Lichtmikroskopie spielt besonders in den Lebenswissenschaften eine herausragende Rolle, weil damit biologische Vorgänge in den Zellen mit nichtinvasiven Verfahren direkt beobachtet werden können. Am wichtigsten ist heute die Fluoreszenzmikroskopie, weil die Wellenlängen der Fluoreszenzemission besonders geeignet sind, Zellbestandteile wie Proteine und Nukleinsäuren spezifisch zu markieren. Durch den Einsatz von Fluoreszenzmarkern können Zellkomponenten spezifisch angefärbt werden, ohne dass die Zelle in ihren Funktionen messbar beeinträchtigt wird; das gilt auch, wenn Zellen gentechnologisch verändert werden, um den entsprechenden Marker - beispielsweise das green fluorescent protein - selbst herzustellen. Durch den Lichtstrahl wird das Markermolekül in einen angeregten Zustand versetzt und emittiert bei der Rückkehr in den Grundzustand das Fluoreszenzlicht; der fluoreszierende Fleck 2

3 Hells STED-Mikroskop in der Abteilung Optische Nanoskopie am Deutschen Krebsforschungszentrum in Heidelberg. DKFZ kann aber gemäß dem Abbeschen Gesetz nicht kleiner als Δd = 200 Nanometer sein. Die Überwindung der Beugungsgrenze gelang Hell durch den von Einstein vorhergesagten Prozess der stimulierten Emission: Licht kann ein angeregtes Molekül auch abregen. Wenn die Intensität dieses Lichtstrahls einen bestimmten Sättigungswert überschreitet, kann die Lichtemission vollständig unterbunden werden ( stimulated emission depletion ). Der Prozess ist reversibel; die abgeregten Moleküle können sofort wieder angeregt und auch wieder abgeregt werden. Indem Hell den auf eine Wellenlänge mit Fluoreszenz- Anregung eingestellten Laserstrahl im Zentrum mit einem ringförmig angeordneten abregenden Lichtstrahl überlagerte, in dessen Bereich die Fluoreszenz ausgelöscht wurde, konnte er erreichen, dass Fluoreszenz nur noch aus einem Spot im zentralen Bereich abgestrahlt wird, der enger als der Lichtfleck des Anregungslichtes ist. Mit zunehmend intensiverem Abregungslicht wird dieser zentrale Bereich immer enger eingeschnürt. Eine Auflösung jenseits der Beugungsgrenze - im Prinzip bis hinab zur Größe von Molekülen - erreicht die STED- Mikroskopie dadurch, dass die Probe mit dem schärferen Fleck Punkt für Punkt abgerastert wird. Das Bild wird mit dem Computer durch Aneinanderreihung der registrierten Fluoreszenzintensität erstellt. Die Größe des Spots und damit die Auflösung im STED-Mikroskop folgt nach Hell einem neuen Gesetz: Δd = λ/(2n sin α (1 + I/I )). Sat Dabei ist I die stimulierte Emission und I Sat die Sättigungsintensität, bei der die Fluoreszenz mit 50 % Wahrscheinlichkeit verhindert wird. Sie hängt vom verwendeten Fluoreszenzfarbstoff ab. Ist die stimulierte Emission gleich Null, erhält man wieder die klassische Abbesche Auflösungsgrenze. STED und biomedizinische Forschung Das STED-Mikroskop ist seit 2007 auf dem Markt und hat seitdem viele überzeugende Beweise seiner Fähigkeiten geliefert. Mit dem Elektronenmikroskop hatte man immer nur Strukturen toter Zellen untersuchen können; nun aber eröffnet die Erfindung Nanometer-genaue Einblicke in lebende Zellen, wie Prof. Otmar Wiestler, Vorstandsvorsitzender des Deutschen Krebsforschungszentrums (DKFZ) in Heidelberg, erläuterte. Durch Kombination von STED- und 4Pi-Mikroskopie ist zudem eine bessere Auflösung der räumlichen Verteilung der Nanostrukturen in der Zelle möglich. 3

4 Die Verteilung der aus dem Splicing Factor SC35 bestehenden speckles im Zellkern. Links mit dem konfokalen Fluoreszenzmikroskop; rechts mit dem STED-Mikroskop. Kooperation mit Prof. P. Lichter am DKFZ, Abteilung Molekulare Genetik. DKFZ Mit seinen Mitarbeitern in der von ihm geleiteten Abteilung Optische Nanoskopie am DKFZ setzt Hell die STED-Mikroskopie in der Erforschung von Krankheiten ein. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe um Prof. Peter Lichter beispielsweise wurde in Zellkernen von Leukämiezellen die dynamische Verteilung von Makromolekül-Komplexen (sogenannte splicing factor compartments oder speckles ) analysiert, die bei der Regulation der Transkription und dem processing von RNA eine Rolle spielen. Zusammen mit dem Virologen Prof. Hans-Georg Kräusslich vom Universitätsklinikum Heidelberg wurde aufgeklärt, dass sich die Rezeptoren auf der Oberfläche des AIDS-Erregers HIV für eine Infektion der Wirtszelle zu einem Cluster zusammenlagern müssen. In Nervenzellen lassen sich schnell ablaufende physiologische Prozesse, wie der Vesikeltransport und die Freisetzung von Botenstoffen an den Synapsen, direkt beobachten, wie Hell bereits mit Filmaufnahmen in Echtzeit mit 33 Bildern pro Sekunde bei einer Auflösung von ungefähr 70 Nanometern demonstrieren konnte. Auch kann man mit dem STED-Mikroskop zeigen, wie Krebszellen miteinander oder mit gesunden Köperzellen Kontakt aufnehmen und wie sich die Zellen bei der Aufnahme bestimmter Wirkstoffe verhalten. Das eröffnet neue Einsichten in die Wirkungsweise von Medikamenten, und die Entwicklungszeit für neue Therapeutika könnte enorm verkürzt werden. Der Nobelpreis für Stefan Hell wird das Anwendungspotenzial der STED-Mikroskopie in der medizinischen Grundlagenforschung erweitern und neue Entwicklungen beflügeln. Originalpublikation: Stefan W. Hell and Jan Wichmann: Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulatedemission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters, Vol. 19, pp (1994) 4

5 Fachbeitrag EJ BioRN BIOPRO Baden-Württemberg GmbH Weitere Informationen Abteilung Optische Nanoskopie, DKFZ Der Fachbeitrag ist Teil folgender Dossiers Molekulare Bildgebung - der tiefe Blick ins Innere 5