L e b e n i n d e r Z w e r g e n d i m e n s i o n
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- Walther Lennart Heidrich
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1 EINSICHTEN 28 N E W S L E T T E R 3 l e b e n s w i s s e n s c h a f t e n Susanne Wedlich L e b e n i n d e r Z w e r g e n d i m e n s i o n Die Rätsel der Zelle besser auflösen das gelingt nun dank einer bahnbrechenden Mikroskoptechnik. Das Team um Professor Heinrich Leonhardt konnte mit dieser neuen Technologie erstmals Strukturen einer Säugerzelle in 3D, mehreren Farben und in bislang unerreichter Auflösung darstellen. Dabei sind Details zu sehen wie das genetische Material, die umgebende Kernhülle und sogar einzelne Kernporen. Die Forscher wollen zelluläre Vorgänge nun auch als 3D Film aufnehmen. Viel hat sich getan seit der Niederländer Antoni van Leeuwenhoek im 17. Jahrhundert die ersten Mikroskope baute. Seine Geräte waren eher extrem starke Lupen, mit deren Hilfe er aber immerhin als erster Bakterien nachweisen konnte. Lichtmikroskope der heutigen Generation dagegen erlauben sogar die Abbildung zellulärer Strukturen. Dabei wird Licht von mehreren Linsen gebündelt, nachdem es von dem Untersuchungsobjekt reflektiert wurde oder dieses durchflossen hat. Eine breit eingesetzte Weiterentwicklung dieser Technik ist die Fluoreszenzmikroskopie. Dabei markieren fluoreszierende Farbstoffe Strukturen, die damit sichtbar sind und in der Zelle lokalisiert und verfolgt werden können. Eine Grenze ist der Lichtmikroskopie in all ihren Varianten aber gesetzt: Die Auflösung, also die Unterscheidbarkeit kleinster Strukturen, hängt von der Wellenlänge des Lichts ab und liegt im Idealfall bei rund 2 Nanometern. Ein Nanometer entspricht einem Milliardstel Meter. Der Begriff Nano leitet sich von dem griechischen Wort für Zwerg her. Es war übrigens ein deutscher Physiker, der Eisenacher Ernst Abbe, der dieses nach ihm benannte Abbe-Limit der Lichtmikroskopie im 19. Jahrhundert entdeckt hat, berichtet Professor Heinrich Leonhardt. Doch die Grenze ist nicht absolut: Es gibt verschiedene Ansätze, dieses Limit zu umgehen, aber keine der bislang entwickelten Techniken konnte bis jetzt breit eingesetzt werden. Deshalb versuchen Wissenschaftler seit Langem, die Methoden zur Abbildung molekularer Strukturen mit den Vorteilen der Lichtmikroskopie, etwa der einfachen Handhabung, zu kombinieren und zwar unterhalb des Abbe-Limits. Eben dies ist uns nun in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Professor John Sedat von der University of California in San Francisco gelungen, sagt Heinrich Leonhardt. Wir errei-
2 chen eine zweifach erhöhte Auflösung von etwa 1 Nanometern. Die Grundlage unseres 3D-SIM-Verfahrens ist immer noch die herkömmliche Lichtmikroskopie, allerdings mit einer besonderen Beleuchtungstechnik (daher der Name: structured illumination microscopy, SIM). Damit machen wir etwas, was man bei Lichtmikroskopen eigentlich tunlichst vermeiden sollten: Wir beleuchten strukturiert. Wir bestrahlen also unsere Proben, etwa eine Zelle, mit einem bekannten und sehr feinen Muster aus Licht. Das führt zu Interferenzen mit den Strukturen der Probe, die sich als Schattenmuster zeigen und die man an sich vermeiden will. Eine ähnliche wellenförmige Interferenz ist in der Grafik als sogenannter Moiré-Effekt bekannt und entsteht etwa beim Einscannen von gedruckten Bildern. Diese auf den ersten Blick störenden Interferenzmuster enthalten aber wertvolle Informationen, meint Heinrich Leonhardt. Mit viel Mathematik und einem guten Computer können wir aus diesen Rohdaten kleinste Strukturen der Probe errechnen, die mit einem einfachen Lichtmikroskop nicht aufgelöst werden können. Das Verfahren wird stufenweise in den verschiedenen Ebenen der Zelle mit unterschiedlichen Farben wiederholt. Aus den Daten wird schließlich im Computer ein mehrfarbiges, dreidimensionales Bild der Zelle mit besonders hoher Auflösung rekonstruiert. Mit dieser Technik können zelluläre Strukturen abgebildet werden, die von konventionellen Lichtmikroskopen nicht erfasst werden, sagt Heinrich Leonhardt. Dies ermöglicht eine ganz neue Art der Analyse in den Lebenswissenschaften: von der Grundlagenforschung bis zu den angewandten Fragestellungen. einblicke in kritische phase der zellteilung Für die Forscher ergaben sich schon während der Entwicklung des Geräts faszinierende neue Einblicke. Sie konnten den Kern einer Säugerzelle kurz vor der Teilung und damit vor einem kritischen Moment in deren Lebenszyklus beobachten. In dieser Phase müssen die zwei Kopien des genetischen Materials peinlich genau auf die beiden Tochterzellen verteilt werden. Fehler bei diesem sensiblen Vorgang können fatal sein: Der Tod der Zelle ist die vergleichsweise harmlose, die Entstehung von Krebs dagegen die sehr viel gefährlichere Konsequenz. Dank der neuen Technik konnten die Wissenschaftler die Kernhülle im Detail sehen. Dazu gehörten die Membran, die das ebenfalls zum Teil sichtbare genetische Material umschließt, sowie Kernporen, also Öffnungen und wichtige Transportwege in der Kernhülle. Besonders interessant waren für uns auch zwei große Einstülpungen in der Kernhülle, erklärt Heinrich Leonhardt. Dort setzen nämlich die sogenannten Zentrosomen an. Von dort aus bilden sich dann lange Fäden, an denen das genetische Material in Form von Chromosomen entlang wandert, um in die Tochterzellen zu gelangen. Diesen grundlegenden biologischen Prozess hat man in einem vergleichbaren Detailreichtum bislang noch nicht sehen können. Aber auch auf der Oberfläche der Chromosomen, also des genetischen Materials, sind neue Einzelheiten zu erkennen. Das ist nur möglich, weil die unterschiedlichen Strukturen verschieden eingefärbt sind und zwar mit herkömmlichen Farbstoffen. Ein herkömmliches Gerät, das sogenannte STED-Mikroskop, kann ebenfalls das Abbe-Limit unterschreiten, ist aber technisch komplex und noch auf spezielle Farbstoffe beschränkt.
3 Das Bild zeigt eine Zelle in der Prophase, d.h. zu Beginn der Zellteilung. Man sieht sehr deutlich die Kondensation der Chromosomen (rot/magenta) und die umgebende Kernhülle (grün), die Einstülpungen und erste Risse zeigt. Im Vergleich zu allen Lichtmikroskopen erreicht wiederum die Elektronenmikroskopie eine noch sehr viel höhere Auflösung, ist aber extrem aufwändig und kann nicht mehrfarbig abbilden. Bilder in 3D in drei oder sogar vier Farben mit sehr hoher Auflösung abzubilden, ist derzeit also nur mit der 3D-SIM-Technik möglich, sagt der LMU- Forscher. Dazu kommt, dass wir etablierte und einfache Verfahren anwenden können, um die Proben aufzubereiten und anzufärben. Schon bald soll der Weg vom 3D-SIM-Prototypen zum kommerziell erhältlichen Gerät führen. Derart groß angelegte Projekte wie die Entwicklung und erste Anwendung dieser Technik sind natürlich immer nur als gemeinschaftliche Anstrengung eines Teams möglich, betont Heinrich Leonhardt. Hier haben zum Beispiel Hard- und Software-Ingenieure sehr eng mit Physikern und Zellbiologen zusammengearbeitet. Langfristig wollen wir jetzt das Verfahren noch verbessern, um Prozesse in lebenden Zellen in 3D filmen zu können. unerreichte dimensionen der mikroskopie Auch mit einem anderen Projekt konnte der Biologe in bislang unerreichte Dimensionen der Mikroskopie lebender Zellen vorstoßen. Im Grunde geht es darum, zelluläre Prozesse und vor allem auch krankmachende Vorgänge auf molekularer Ebene besser zu verstehen, meint er. Das geht aber nur, wenn man zuverlässige Informationen über die Menge, die Lokalisierung und die Veränderungen der betreffenden zellulären Bestandteile hat. Als wertvollstes Hilfsmittel haben sich dafür in den letzten Jahren Antikörper etabliert, weil sie zum Nachweis biologischer Moleküle und Strukturen in Forschung, Diagnostik und Therapie eingesetzt werden können. Antikörper oder Immunglobuline gehören zum Abwehrarsenal des Immunsystems höherer Wirbeltiere und sind wahre Verwandlungskünstler. Jedes dieser Immunmoleküle erkennt hoch spezifisch eine andere Struktur, ein sogenanntes Antigen. Sie patrouillieren im Blut und anderen Körperflüssigkeiten auf der Suche nach Krankheitserregern und anderen fremden Objekten. Die Grobstruktur aller Antikörper ist gleich und ähnelt dem Buchstaben Y. Nur die äußerste Spitze an den beiden kurzen Armen ist außerordentlich variabel. Mit Hilfe dieser Domänen erkennt jeder Antikörper sein Antigen und bindet daran. Nur anhand dieser hypervariablen Regionen unterscheiden sich die vielen Millionen Antikörper eines Organismus und können ebenso viele Antigene erkennen. Die hochspezifische Bindefähigkeit der Immunglobuline, die nahezu jedes Antigen und jede zelluläre Struktur erkennen können, hat man sich auch in der Biomedizin zunutze gemacht. Dort werden gezielt Antikörper für gesuchte biomolekulare Strukturen produziert und anschließend mit einem Marker gekoppelt. Ist die entsprechende Struktur in einer 3
4 Zelle oder einem Gewebe vorhanden, wird der Antikörper daran binden, was wiederum über den Marker nachgewiesen werden kann. Denn dabei handelt es sich in der Regel um einen fluoreszierenden Farbstoff, der im Mikroskop sichtbar gemacht werden kann. Kurz gesagt: Wo der Marker aufleuchtet, ist der Antikörper und damit auch das gesuchte Molekül zu finden. Antikörper sind zweifellos das wichtigste Hilfsmittel der biomedizinischen Forschung und Diagnostik, sagt Heinrich Leonhardt. Sie haben aber auch einen entscheidenden Nachteil: Für viele Untersuchungen sind Antikörper schlichtweg zu groß, auch wenn mittlerweile kleinere Moleküle entwickelt wurden. Außerdem können mit ihrer Hilfe nur einzelne Schnappschüsse gewonnen werden, bislang aber war es nicht möglich, dynamische Prozesse in lebenden Zellen zu untersuchen. Doch eben diese Vorgänge werden für die Wissenschaft immer interessanter: So geht es zunehmend seltener nur um die Frage, wo und in welcher Menge sich ein Protein zu einem gegebenen Zeitpunkt in der Zelle befindet. Vielmehr soll jetzt geklärt werden, wie sich Proteine in der Zelle bewegen, wie sie interagieren und sich dabei verändern. Das aber kann nur in lebenden Zellen untersucht werden. Antikörper aber kommen normalerweise im Körper nur außerhalb von Zellen vor. Wenn sie also in den Zellen produziert werden, sind sie meist nicht funktionstüchtig. Als Proteine müssen sie nämlich eine spezifische dreidimensionale Struktur einnehmen, um ihre Aufgaben erfüllen zu können. In den Zellen werden sie meist aber falsch gefaltet und sind damit unbrauchbar. wie chromobodies erzeugt werden Diese konventionellen Antikörper bestehen aus insgesamt vier Ketten. Das Grundgerüst bilden die beiden schweren Ketten, die teilweise aneinander binden: So entsteht der Stamm der Y-förmigen Struktur. An die freien Enden der beiden Moleküle bindet je eine der beiden leichten Ketten: So entstehen die beiden kurzen Arme, deren Spitzen alleine für die Erkennung des zugehörigen Antigens verantwortlich sind. Kamele und die verwandten Alpakas besitzen jedoch zusätzlich wesentlich kleinere, einzelkettige Antikörper, berichtet Heinrich Leonhardt. Ihnen fehlen die leichten Ketten. Ihre Antikörper binden über eine einzelne variable Region. Das ist das kleinste aus der Natur bekannte Antigen-bindende Fragment. Für ihren Ansatz haben die Forscher deshalb nur die Antigen-bindende Domäne dieser einzelkettigen Antikörper verwendet. Sie ist insgesamt zehnmal kleiner als ein konventioneller Antikörper und erhielt daher den Namen Nanobody. Durch Fusion mit fluoreszierenden Proteinen erzeugten Leonhardt und sein Mitarbeiter Dr. Ulrich Rothbauer dann leuchtende Nanosonden, sogenannte Chromobodies. Dank ihrer geringen Größe und ihrer Stabilität können Chromobodies sogar in lebenden Zellen eingesetzt werden. Unsere leuchtenden Designermoleküle können von den Zellen selbst produziert werden. Sie heften sich dann an die entsprechenden Antigene und verfolgen deren Weg und Schicksal in den Zellen. Dabei beschränkt sich das Verfahren nicht nur auf Proteine. Es können jetzt ebenso deren chemische Modifikationen und andere Zellkomponenten untersucht werden, was bislang unmöglich war. Wegen ihrer geringen Größe können die Chromobodies aber auch sehr leicht hergestellt werden. Zudem sind sie außerordentlich stabil. Sie können also
5 Für ihren Ansatz nutzen die Forscher um Heinrich Leonhardt die Antigen-bindende Domäne der einzelkettigen Antikörper, die sie aus Kamelen oder Alpakas gewinnen. Sie ist insgesamt zehnmal kleiner als ein konventioneller Antikörper und erhielt daher den Namen Nanobody. Durch Fusion mit fluoreszierenden Proteinen erzeugen die Forscher leuchtende Nanosonden, sogenannte Chromobodies. Dank ihrer geringen Größe und ihrer Stabilität können Chromobodies sogar in lebenden Zellen eingesetzt werden. auch für diagnostische Zwecke in lebenden Zellen genutzt werden. Aber auch in anderer Hinsicht sind die Kamel-Antikörper eine willkommene Alternative: Bislang wurden konventionelle Antikörper in Tieren, vor allem in Kaninchen, Mäusen, Ratten, Hühnern, Ziegen und Schafen, hergestellt. Für die Nanobody-Technologie ist dies nun nicht mehr nötig. Die Antikörpervielfalt kann dank der einfachen Struktur von Nanobodies in künstlichen, molekularen Bibliotheken angelegt werden, von denen es bereits mehrere gibt: Sie enthalten Milliarden von Chromobodies, die zunächst zwar aus immunisierten Kamelen und Alpakas gewonnen werden mussten. Zukünftig soll diese Technologie aber den Einsatz der Tiere ersetzen. Ausgewählte Nanobodies können dann in fast beliebigen Mengen in Bakterien produziert werden. Und die Bibliotheken haben sich bereits bewährt: Wir konnten einige spezifische Sonden für verschiedene biologische Zielstrukturen gewinnen, berichtet Heinrich Leonhardt. Mit Hilfe dieser Chromobodies können wir Prozesse in Zellen verfolgen, beeinflussen und auch blockieren das erlaubt ganz neuartige funktionelle Studien. So konnten wir zum Beispiel eine Nano-Falle entwickeln, mit deren Hilfe interagierende Proteine in der Zelle nachgewiesen, eingefangen und isoliert werden können. Die Möglichkeiten sind fast unbegrenzt. Prof. Dr. Heinrich Leonhardt ist seit 22 Professor für Molekulare Humanbiologie am Biozentrum der LMU. Er forscht in den Exzellenzclustern Nanosystems Initiative Munich (NIM) und Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM).
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