Super-auflösende Fluoreszenzmikroskopie mit einzelnen Molekülen Autor: Carsten Forthmann*, Jürgen Schmied* und Philip Tinnefeld *

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1 Fluoreszenzmikroskopie Super-auflösende Fluoreszenzmikroskopie mit einzelnen Molekülen Autor: Carsten Forthmann*, Jürgen Schmied* und Philip Tinnefeld * Das Auflösungsvermögen der optischen Mikroskopie wird durch das so genannte Abbe sche Beugungslimit eingeschränkt. Die nacheinander erfolgende Detektion einzelner Moleküle mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie kann diese Beschränkung umgehen und somit die Auflösung drastisch erhöhen. Die Entdeckung biologischer Zellen und die Untersuchung ihres Aufbaus waren mit der Erfindung des Mikroskops im 16. Jahrhundert und seiner stetigen Verbesserung verbunden. Bei den ersten Mikroskopen der Renaissance handelte es sich um so genannte Lichtmikroskope. Diese können so konstruiert werden, dass sie einen Gegenstand beliebig vergrößern. Jedoch kann kein Lichtmikroskop Einzelheiten von weniger als einigen hundert Nanometern auflösen. Dies entspricht ungefähr der Hälfte der Wellenlänge des sichtbaren Lichts. Die meisten Strukturen im Inneren von Zellen sind daher zu klein, um mit dem Lichtmikroskop untersucht werden zu können. Proteine haben z.b. eine Größe von wenigen Nanometern, Proteinkomplexe und kleine Organellen sind 10 bis 100 nm groß. Diese sichtbar zu machen war erst durch die Entwicklung der Elektronen-mikroskopie in den Dreißigerjahren möglich. Bei dieser Technik wird statt Licht ein Elektronenstrahl genutzt. Da nun Abb. 1: die Wellenlänge eines solchen Elektronenstrahls deutlich kürzer ist als die des sichtbaren Lichtes, Fluoreszenzmikroskopische ist die Auflösung entsprechend höher. Sie liegt im Bereich von weniger als einem Nanometer. Ein Aufnahme einer Zelle. (Bild: großer Nachteil der Elektronenmikroskopie ist jedoch die komplizierte Probenpräparation und die wikipedia.org) hohe Invasivität. Die Anwendung auf lebende Strukturen ist daher nicht möglich. Die einzige Möglichkeit, die Lebensvorgänge in einer Zelle in Detailschärfe mit verfolgen zu können, besteht also darin, das seit dem 19. Jahrhundert als Dogma anerkannte Abbe sche Beugungslimit auszutricksen. Das wird möglich, wenn das Phänomen der Fluoreszenz zunutze gemacht wird. Bildergalerie Klicken Sie auf ein Bild um die Bildergalerie zu öffnen (5 Bilder) Fluoreszenzmikroskopie Eine besondere Form der Lichtmikroskopie ist die so genannte Fluoreszenzmikroskopie. Als Fluoreszenz bezeichnet man die Eigenschaft bestimmter Stoffe (den so genannten Fluoreszenzfarbstoffen), bei Bestrahlung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge, Fluoreszenzlicht auszusenden. Aufgrund des Farbunterschiedes zwischen dem Anregungslicht und dem Fluoreszenzlicht, lässt sich das Anregungslicht ausblenden. Werden nun bestimmte Strukturen in einer Zelle chemisch mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert, lassen sich diese sehr kontrastreich abbilden (s. Abb. 1). Allerdings gilt natürlich auch für diese Technik das Beugungslimit, sie ist also unscharf. Seite 2 Blinkmikroskopie Blinkmikroskopie Empfindliche Detektoren machen es mittlerweile möglich, einzelne Fluoreszenz-Farbstoffmoleküle zu beobachten, wodurch die Veränderung der Helligkeit eines einzelnen Moleküls über die Zeit untersucht werden kann. Sendet ein Farbstoff gleichmäßig helles Fluoreszenzlicht aus, so spricht man von einem Hell- bzw. Anzustand. Aus einem solchen Hellzustand kann das Molekül in einen Dunkel- bzw. Auszustand übergehen. Erfolgt dieser Übergang irreversibel, spricht man von bleichen, andernfalls von blinken. Durch die Möglichkeit, diese Übergänge an einzelnen Molekülen beobachten und studieren zu können, lassen sich Seite 1 / 8

2 die dahinter stehenden photophysikalischen Prozesse nicht nur verstehen, sondern sogar nach Belieben beeinflussen. So lassen sich z.b. Fluorophore bei maßgeschneiderten An- und Auszeiten gezielt zum Blinken bringen. Solche schaltbaren Moleküle sind der Schlüssel zur Überwindung des Beugungslimits und damit auch zur superauflösenden Mikroskopie. Das funktioniert wie folgt: Wird die farbstoffmarkierte Struktur (in Abb. 2 schwarz dargestellt) mit Licht der richtigen Wellenlänge bestrahlt, so erzeugt jeder einzelne Farbstoff auf dem Bild einen verschwommenen Lichtfleck. In der Summe ergeben all diese sich überlappenden Lichtflecke ein sehr unscharfes Bild der Gesamtstruktur (rot in Abb. 2). Anders sieht die Sache aus, wenn die Fluorophore so blinken, dass sie immer nur kurz aufblitzen und ansonsten vollkommen dunkel sind. Das ist in Abbildung 2 dargestellt. Nimmt man unter diesen Bedingungen einen Film der Probe auf, so ist auf keinem Bild die gesamte Struktur zu sehen, sondern immer nur einige wenige Farbstoffmoleküle. Die verschwommenen Lichtflecke der einzelnen Fluorophore überlappen nun nicht mehr und so kann für jeden dieser Lichtflecke die Lage des Mittelpunkts mit sehr hoher Genauigkeit ausgemessen werden. Der Mittelpunkt spiegelt genau die Position des markierten Moleküls wider. Wird diese Prozedur in jedem Filmbild wiederholt, so erhält man am Ende eine Menge von Punkten, die zusammengesetzt ein sehr detailliertes Bild der betrachteten Struktur ergeben (s. Abb. 3) [3, 4]. Quantitative Auflösung Die Frage, die sich stellt, ist, welche Auflösung denn eigentlich erzielt werden kann. Um das zu vermessen, benötigt man ein so genanntes Nanometerlineal, also eine Struktur, die in genau definierten Abständen Farbstoffe trägt. Der frei einstellbare Farbstoffabstand wird dabei solange verkürzt, bis das verwendete superauflösende Mikroskop die einzelnen Farbstoffmoleküle nicht mehr getrennt abbilden kann. Auf diese Weise lässt sich das Auflösungsvermögen des Mikroskops experimentell bestimmen. Realisiert wurde ein solches Nanometerlineal kürzlich durch eine DNA-Nanostruktur, ein so genanntes DNA- Origami. Ein DNA-Origami besteht aus einem langen DNA-Strang, der durch zahlreiche kurze DNA-Stränge so zusammen getackert wird, dass da- raus eine ganz bestimmte Figur entsteht. Die Form dieser Figur hängt von der Wahl der Tacker - Stränge ab und ist nahezu beliebig wählbar [3]. Im Fall des Nanometerlineals wird allerdings nur ein simples Rechteck verwendet (s. Abb. 4) [4]. Da genau bekannt ist, an welcher Stelle des Rechteckes welcher Tacker-Strang sitzt und jeder Tacker-Strang eine mögliche Anbindungsstelle für ein beliebiges Molekül ist, kann ein solches DNA-Origami als molekulare Legoplatte genutzt werden, auf der Farbstoffe in beliebigem Muster angeordnet werden können. Auf diese Weise hergestellte Nanometerlineale wurden schon an vielen Mikroskopen erfolgreich eingesetzt und sollen bald kommerziell erhältlich sein. Auf den Punkt gebracht Das Auflösungsvermögen eines Lichtmikroskops ist durch das Abbe sche Beugungslimit auf ca. 200 nm begrenzt. Die weit höhere Auflösung der Elektronenmikroskopie ist aber ungeeignet für lebende Proben. Mithilfe des Phänomens der Fluoreszenz und einem einfachen Trick lässt sich das Beugungslimit allerdings austricksen und das Auflösungsvermögen deutlich verbessern. Durch Verwendung von künstlich erzeugten Nanostrukturen ist die gewonnene Auflösungsverbesserung auch quantitativ bestimmbar. Die Anwendung dieser neu entwickelten Methode auf lebende Zellen ist Gegenstand hochaktueller Forschung im Bereich der Biophysik und Zellbiologie. Literatur [1] C. Steinhauer, C. Forthmann, J. Vogelsang, P. Tinnefeld, Superresolution Microscopy on the Basis of Engineered Dark States, J. Am. Chem. Soc [2] J. Vogelsang, T. Cordes, C. Forthmann, C. Steinhauer, P. Tinnefeld, Exquisite Control of Fluorescence: Oxazines as Single-Molecule Switches, Proc Natl Acad Sci U S A 2009 [3] P. Rothemund, Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns, Nature 2006 [4] C. Steinhauer, R. Jungmann, T. Sobey, F. Simmel, P. Tinnefeld, DNA-Origami als Nanometerlineal für die superauflösende Mikroskopie, Angew Chem Int Ed 2009 * C. Forthmann, J. Schmied und P. Tinnefeld: Institut für theoretische und physikalische Chemie der TU Braunschweig, Braunschweig Redakteur: Marc Platthaus Dieser Beitrag ist urheberrechtlich geschützt. Sie wollen ihn für Ihre Zwecke verwenden? Infos finden Sie unter Seite 2 / 8

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4 Abb. 2: Schematische Darstellung des Prinzips der Blinkmikroskopie. (Bild: TU Braunschweig) Seite 4 / 8

5 Abb. 3a: Immobilisierte Aktinfilamente beugungsbegrenzter Auflösung. (Bild: TU Braunschweig) Seite 5 / 8

6 Abb. 3b: Immobilisierte Aktinfilamente und in Superauflösung. (Bild: TU Braunschweig) Seite 6 / 8

7 Abb. 3c: Immobilisierte Aktinfilamente: einige Frames mit blinkenden Molekülen. (Bild: TU Braunschweig) Seite 7 / 8

8 Abb. 4: Auf einem DNA-Origami realisiertes Nanometerlineal. Die beiden Farbstoffe (F) weisen hier einen Abstand von 90 nm auf. (Bild: TU Braunschweig) Seite 8 / 8