Einzelmolekülspektroskopie

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1 Physikalisches Institut der Universität Bayreuth Physikalisches Praktikum für Fortgeschrittene Einzelmolekülspektroskopie U. Gerken 1

2 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Versuchsaufbau Versuchsdurchführung Bestimmung der Apparate-Parameter Einzelmolekülspektroskopie Ensemblespektroskopie Auswertung mit ImageJ Weiterführende Literatur

3 1. Einleitung Die Einzelmolekülspektropie ist ein relativ junger Zweig der optischen Spektroskopie, so gelang erstmals 1989 der optische Nachweis einzelner Pentazen-Moleküle [W.E: Moerner & L. Kador, Phys. Rev. Letters (62), 2535, (1989)]. Dieses Gebiet hat sich seitdem rasant entwickelt und es werden immer neue Anwendungsbereiche in den Bereichen Physik, Biologie, Chemie, Informationstechnik usw. gefunden. Spektroskopie an einzelnen Molekülen erlaubt die Bestimmung molekularer Parameter, die in Ensemblemessungen und dem damit verbundenen Mittelungprozess verborgen bleiben. Zu diesen Parametern gehören u.a. die natürliche Linienbreite eines Übergangs, die Polarisation des emittierten Lichtes und der Ort eines Chromophors. Ebenfalls lassen sich Quanteneffekte wie Photonbunching und antibunching nur an Einzelmolekülproben nachweisen. Durch einzelne Farbstoff-markierte Proteine bzw. Biomoleküle kann man z.b. Diffusionsund Transportprozesse innerhalb von lebenden Zellen gezielt verfolgen. Die besondere experimentelle Herausforderung in der Einzelmolekülspektroskopie besteht darin, die (geringe) Fluoreszenz des zu untersuchenden einzelnen Chromophors zu detektieren. Weiterhin ist dieses Signal von der Fluoreszenz der anderen Chromophoren, von der Fluoreszenz der umgebenden Matrix sowie von gestreutem Anregungslicht zu trennen. Dies geschieht durch den Einsatz Einzelphotonen-empfindlicher Detektoren wie der Avalanche Photodiode (APD) in Verbindung mit konfokaler Mikroskopie. Moderne CCD- oder CMOS-Kameras erlauben heutzutage auch Weitfeld-Aufnahmen mit Einzelphotonenempfindlichkeit. Weiterhin müssen die Chromophore in sauberen Umgebungen (Lösemittel oder feste Matrices) so stark vereinzelt, d.h. verdünnt (~10-9 M), vorliegen, dass sie mit optischen Methoden räumlich getrennt dargestellt werden können. Der Einsatz optischer Bandpassfilter, die das Anregungslicht mit optischen Dichten von <10-6 nahezu komplett unterdrücken, aber im Bereich der Fluoreszenz vollständig transparent sind, ermöglicht ein hohes Signal-zu-Rausch Verhältnis. 3

4 Abbildung 1: Fluoreszenzspektrum von Perylenbisimid (PBI) in Lösung. In diesem Praktikum wird als Chromophor in Toluol gelöstes Perylenbisimid (PBI) verwendet, welches in eine Polystyrol (PS) Matrix eingebettet wird. Das Ensemble- Fluoreszenzspektrum sowie die Strukturformel des PBI sind in Abb. 1 dargestellt. Ziel des Praktikums ist es, grundlegende Prinzipien und Techniken der Einzelmolekülspektroskopie anzuwenden und zu verstehen. Literatur Eine Einführung in das Gebiet der Einzelmolekülspektroskopie ist zu finden in Principles of Fluorescence Spectroscopy (Kapitel 23, ) von Joseph R. Lakowicz. Die Volltextversion dieses Buches ist über den Kataolg der Universitätsbibliothek abrufbar. Fragen und Stichpunkte zur Vorbereitung Was ist Fluoreszenz? Franck-Condon-Prinzip Aufbau eines konventionellen Lichtmikroskopes Bildentstehung in einem konventionellen Licht- bzw. Fluoreszenzmikroskop Aufbau eines konfokalen Mikroskopes Was ist eine point-spread-function (PSF)? 4

5 Was versteht man unter dem Auflösungsvermögen eines Mikroskops bzw. eines Spektrometers? Photonenstatistik: thermische Lichtquelle, Laser und einzelnes Molekül. Was sind die Vor- und Nachteile der Einzelmolekülspektroskopie? 2. Versuchsaufbau Der Versuchsaufbau ist schematisch in Abb. 2 dargestellt. Die Probe wird mit der 514 nm Linie eines Ar + /Kr + -Gaslasers angeregt. Die Anregungsleistung kann mit dem Graufilterrad stufenlos variiert werden und wird mit der Photodiode gemessen. Das Anregungslicht wird über einen dichroitischen Spiegel in das Mikroskopobjektiv (100, NA1,3) gelenkt. Das Fluoreszenzlicht aus dem Fokus passiert den Dichroiten und gelangt entweder zum Photonendetektor (APD, Avalanche Photodiode) oder durch den Klappspiegel zum Gitterpektrographen (150 Linien/mm bzw. Spiegel). Der Spektrograph besitzt als Detektor eine hochempfindliche CCD-Kamera. Der Bandpassfilter vor dem Klappspiegel sorgt dafür, dass nur die zu untersuchende Fluoreszenz und nicht die Reste des Anregungslichtes zu den Detektoren gelangt. Abbildung 2: Versuchsaufbau zur Einzelmoleküldetektion. Die Pfeile an den Bauteilen deuten an, dass diese aus dem Strahlengang herausgeklappt werden können. 5

6 Die Probe ist auf einem motorisierten x/y-verschiebetisch befestigt, der es ermöglicht, die Probe mit hoher Genauigkeit (0,1µm) zu positionieren. Die Ansteuerung der einzelnen Geräte des Aufbaus erfolgt über den Messplatzrechner. Ein Screen-Shot in Abb. 3 zeigt die einzelnen Programme, die in diesem Praktikum verwendet werden. Abbildung 32: Screen-Shot des Messplatzrechners. Eine Einweisung in die Geräte- und Programmbenutzung erfolgt durch den Betreuer. Für die Auswertung werden folgende Angaben zur CCD-Kamera benötigt: Pixelanzahl des CCD-Chips: Pixel (Breite Höhe) Größe pro Pixel: 6,45 6,45 µm 2 Bitte beachten Sie, dass bei den Spektroskopieversuchen ein 2x2 Binning benutzt wird. 6

7 3. Versuchsdurchführung Nach dem Auflegen einer Probe muss diese in die Fokalebene des Objektives gefahren werden. Der Abstand der Deckglasoberfläche zum Fokus kann dabei mit einfachen Mitteln kontrolliert werden. Entfernen Sie dazu die Weitfeldlinse sowie den Bandpassfilter aus dem Strahlengang, öffnen Sie den Shutter und stellen Sie eine Anregungsleistung von 1mW ein. Nähern Sie die Probe dem Objektiv und beobachten Sie dabei das rückreflektierte Anregungslicht am Ort des Bandpassfilters mit Hilfe eines Stück weißen Papiers. Die Probe befindet sich im Fokus, wenn man einen parallelen Strahl (Durchmesser 5mm) beobachtet. Während der Versuchsdurchführung wird der Mikroskopaufbau in 2 verschiedenen Modi betrieben: Im Weitfeldmodus (ähnlich einem konventionellen Lichtmikroskop) wird die Probe großflächig angeregt und man erhält ein Fluoreszenzbild der Probe. Dazu werden die Weitfeldlinse und der Umlenkspeigel in den Strahlengang geklappt. Die Bildaufnahme erfolgt durch den weit geöffneten Spalt (Stellschraube im Uhrzeigersinn drehen) des Spektrographen mit der CCD- Kamera. Die Parameter für den Spektrographen sind dabei: wavelength 0.00nm + grating. Tur: 1 1, Blz=Mirror. Im konfokalen Modus wird nur ein, durch den Fokus des Objektives definierter Punkt, der Probe angeregt und man erhält nur das Fluoreszenzsignal aus diesem räumlich eng begrenzten Bereich. In diesem Modus muss die Weitfeldlinse WL aus dem Strahlengang entfernt werden. Von diesem Signal kann entweder ein Spektrum oder der zeitliche Verlauf der Fluoreszenz, ein sog. Trace, mit der APD gemessen werden. Soll in diesem Modus ein Spektrum aufgenommen werden, so ist der Umlenkspiegel in den Strahlengang einzuklappen. Die Parameter für den Spektrographen sind dabei: wavelength 600nm + grating. Tur: 1 2, Blz=500nm. 7

8 In beiden Betriebsarten muss sich der Bandpassfilter BP im Strahlengang befinden. Die zu benutzenden Graufilter sowie die Laserleistung für die verschiedenen Messungen entnehmen Sie der Tabelle am Ende des Skripts. Alle mit dem Spektrographen aufgezeichneten Bilder werden zur besseren Auswertung als ASCII- bw. AVI-Datei abgespeichert und sollen mit dem Freeware- Programm ImageJ ( bearbeitet und ausgewertet werden. Aus Sicherheitsgründen und zur Vermeidung des Photobleichens der Probe ist der Shutter beim Wechseln der Probe und der Weitfeldlinse sowie, wenn nicht gemessen wird, zu schließen Bestimmung der Apparate-Parameter Kalibration des Spektrographen Für die Wellenlängenkalibration des Spektrographen bzw. der CCD-Kamera benutzen Sie das Licht der Deckenlampe. Klappen Sie dem Umlenkspiegel in den Strahlengang und entfernen Sie die Lichtschutzkappe des Objekttisches. Fahren Sie den Spektrographen auf eine Wellenlänge von 600 nm (grating. Tur: 1 2) und regeln Sie die Spaltbreite so ein, dass Sie bei einer Belichtungszeit von 500 ms die in Abb. 3 dargestellten Linien erkennen können. Aufgabe: Für die Auswertung der Einzelmolekülspektren aus den CCD-Aufnahmen benötigen Sie die Dispersion nm/pixel des Spektrographen. Berechnen Sie diese aus dem aufgenommenen Spektrum und stellen Sie das Spektrum wie in Abb. 4 (B) dar. Die Linienpositionen entnehmen Sie Abb. 4B: Bestimmung der Vergrößerung und der point spread function (PSF) Befestigen Sie ein sauberes Deckglas auf dem Objekttisch des Mikroskop-Aufbaus und pipettieren sie 30µL der FluoSpheres -Lösung in die Mitte des Deckglases. Machen Sie im Weitfeldmodus eine Aufnahme der Probe (Belichtungszeit ms). Verfahren Sie die Probe mit dem motorisierten Verschiebetisch um 5, 10 und 15 µm und nehmen Sie erneut ein Bild auf. 8

9 Aufgabe: Bestimmen Sie aus der Verschiebung eines markanten Punktes die Vergrößerung des Weitfeldaufbaus. Aufgabe: Bestimmen Sie aus dem Fluoreszenzprofil und der Vergrößerung von 3 FluoSpheres die Breite (FWHM) der PSF und vergleichen Sie diesen mit dem theoretischen Wert :. Dabei ist em die emissionswellenlänge des Fluorophores( hier 600 nnm). Abbildung 4: Spektrum der Deckenlampe (Leuchtstoffröhre). (A) Bild auf der CCD-Kamera des Spektrographen (300 Furchen/mm) und (B) Spektrum, berechnet aus der Integration des Signals in dem in (A) umrandeten Bereich. Die Linien der Wellenlängen 546,07, 576,96 und 579,07 nm sind Emissionslinien des Quecksilbers, die Linie bei 611 nm ist eine Emissionslinie des Leuchtstoffes Eu 3+. 9

10 3.2 Einzelmolekülspektroskopie Probenvorbereitung Stellen Sie jeweils 100 µl eine M M PBI-Lösung durch Verdünnen einer 70 nm Stammlösung (Lösemittel Toluol) her. Benutzen Sie zum Verdünnen eine Polystyrol(PS)-Lösung (5 mg/ml in Toluol). 35 µl von der 2x M Lösung werden dann mit dem Spin Coater auf ein vorher gesäubertes Mikroskopiedeckglas aufgebracht. Abbildung 5: (A) Weitfeldaufnahme einer Einzelmolekül-Probe von PBI auf Glas (ohne PS-Matrix) mit einer Konzentration von 5 nm und Intensitätsprofile der Fluoreszenz zweier Moleküle. (B) Zeitliches Verhalten (der sog. Trace) der Fluoreszenz eines PBI-Moleküls. 10

11 Legen Sie die Probe der 2x10-10 M PBI-Lösung mit der beschichteten Seite nach oben auf den Probenhalter und erzeugen Sie ein Weitfeldbild (Belichtungszeit ms). Abbildung 5A zeigt eine Weitfeldaufnahme einer solchen PBI-Probe. Achten Sie darauf, dass das 2x2 Binning der CCD-Kamera eingestellt ist. Aufnahme eines Spektrums Positionieren Sie ein Molekül mit Hilfe des motorisierten Verschiebetisches in das Zentrum des Fadenkreuzes und schließen Sie den Spalt soweit, dass die Spaltränder das Fadenkreuz berühren. Wechseln Sie in den konfokalen Modus und überprüfen Sie am Signal der APD, ob die Zählrate >20k cps beträgt. (Nur bei diesen Zählraten ist die Aufnahme eines Spektrums möglich. Falls die Zählrate geringer ist, suchen Sie ein anderes Molekül.) Schließen Sie dann den Shutter, klappen den Umlenkspiegel ein und nehmen Sie ein Spektrum auf. Die Spektren werden als Film aufgenommen: 14 Bilder mit 500ms Belichtungszeit und als AVI-Format abgespeichert. Ein Spektrum eines einzelnen PBI-Moleküls in einer PS-Matrix ist in Abb. 6 gezeigt. Es sollen von ca. 20 verschiedenen Molekülen Spektren aufgenommen werden. Abbildung 6: Spektrum eines einzelenen PBI-Moleküls in einer PS-Matrix und das dazugehörige Frank-Condon Diagramm. Das Linienprofill wurde mit 2 Gauß-Funktionen (rote Linie) angepasst. Die Lagen der Übergänge sind eingezeichnet. Aufgabe: Bestimmern Sie aus den Spektren die Wellenlängen des 0* 1 Übergangs von PBI und erstellen Sie daraus ein Histogramm. Falls die Bande des 0* 2 11

12 Überganges in den Spektren zu erkennen ist, tragen Sie die Wellenlängen ebenfalls in das gleiche Histogramm ein, und geben Sie den Unterschied der beiden Übergänge in Wellenzahlen (cm -1 ) an. Aufnahme des zeitlichen Fluoreszenzverhaltens Nehmen Sie mit der APD von ca. 5 verscheidenen Molekülen das zeitliche Fluoreszenzverhalten (Trace) auf. Versuchen Sie dabei ein paar Molekükle zu finden, die ein ausgeprägtes blinking zeigen. Was könnten die Ursachen für das beobachtete Blinken sein? 3.3 Ensemblespektroskopie Pipettieren Sie 10 µl der fachen Verdünnung auf die Probe direkt über die Öffnung des Objektives (Shutter muss geschlossen sein!) und lassen sie die Probe für ein paar Minuten eintrocknen. Nehmen Sie anschliesend ein Spektrum auf. Aufgabe: Vergleichen Sie das Ensemblespektrum mit den Einzelmolekülspektren und dem Histogramm der Übergänge. 4. Auswertung mit ImageJ Öffnen eines Bildes im txt-format: File Import Text Image Datei auswählen. Der zu analysierende Bereich wird mit dem Rectangular-Werkzeug ausgewählt. Anschließend werden mit der Tastenkombination Strg K alle Zeilen im ausgewählten Bereich aufaddiert und als Profil (Spektrum) dargestellt. Öffnen einer Datei im avi-format: File Import AVI Datei auswählen. Über alle 16 Bilder des Films soll gemittelt werden: Image Stacks Z Project. 12

13 Wählen Sie Average Intensity und benutzen Sie, wie vorher beschrieben, das Rectangular-Werkzeug, um ein Spektrum zu erzeugen. 13

14 Graufilter vor Mikroskop (OD) P Laser (mw) LP- Filter WF- Linse Sonstiges Fokus-Check (CCD) 2,3 + 2,6 + 1,4 0,1 nein nein t exp = 100 ms Fokus-Check (APD) 2,3 + 2,6 + 1,4 0,1 nein nein 60k - 70k cps beads-probe, Weitfeld-Abbildung beads-probe, Spektrum / konfokal beads-probe, Trace / konfokal PBI-Probe, Weitfeld-Abbildung PBI-Probe, Trace / konfokal 1,3 0,5 ja ja t exp = 100 ms 2,3 + 2,6 0,1-0,5 ja nein t exp = ms 2,3 + 2,6 0,1-1 ja nein 10k - 100k cps 0,3 1-2 ja ja t exp = ms 0,3+1,4 1-2 ja nein 10k - 30k cps PBI-Probe, Spektrum / konfokal 0,3+1,4 1-2 ja nein t exp = 500 ms 16 frames 14

15 5. Weiterführende Literatur Principles of Fluorescence Spectroscopy, Joseph R. Lakowicz, New York, Springer, Handbook of biological confocal microscopy, Hrsg. James B. Pawley, New York, Springer, Modern optical spectroscopy, William W. Parson, Berlin, Springer,