Zellbiologie. Lichtmikroskopie Elektronenmikroskopie Biologische Membranen Membranverbindungen

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Frauke Diefenbach
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1 Zellbiologie Lichtmikroskopie Elektronenmikroskopie Biologische Membranen Membranverbindungen

2 Elektronenmikroskopie 1924 erkannte der Belgier L. de Broglie den Wellencharakter von Elektronenstrahlen M. Knoll und E. Ruska bauten 1931 den ersten Prototyp in Berlin Das erste EM-Bild war die Darstellung des Tabakmosaikvirus Das erste EM-Bild einer Zelle wurde 1945 von K.R. Porter, A. Claude und E.F. Fullam am Rockefeller Institut, New York, veröffentlicht

3 Dr. Max Knoll und Ernst Ruska entwickelten 1931 an der Uni Berlin das erste Transmissions-Elektronenmikroskop ( Übermikroskop ) Physik-Nobelpreis 1986 Ernst Ruska ( )

4 Auflösung Lichtmikroskop d min = λ A Obj + A Kond. Elektronenmikroskop d min = λ A Auflösungsvermögen: (Dicke einer Biomembran: LM EM ~ 200 nm ~ 1 nm ~ 10 nm)

5 Kathode Anode

6 Elektronenmikroskopie die konventionelle Elektronenmikroskopie ist die Transmissionsslektronenmikroskopie (TEM) der Elektronenstrahl wird an einer aufgeheizten Kathode (z.b. Wolframdraht) erzeugt an der Anode wird eine Beschleunigungsspannung ( kv) angelegt durch einen Kondensor wird der Strahl gebündelt der Grad der Ablenkung am Präparat hängt von der Elektronendichte der Atome ab bei biologischen Präparaten (C, H, N, O) ergibt sich nur ein geringer Kontrast vom Objektiv wird ein Zwischenbild erzeugt, das durch ein Projektiv nachvergrößert wird das Bild wird auf einem Leuchtschirm sichtbar gemacht der Schwärzungsgrad spiegelt die Elektronendichte im durchstrahlten Präparat wider

7 Chemische Fixierung Das Präparat wird in Glutaraldehyd oder Formaldehyd fixiert Mit einem Phosphatpuffer wird das Fixiermittel abgewaschen Anschließend wird mit Osmiumtetroxid (OsO 4, zur Festigung von Membranen) nachfixiert In einer aufsteigenden Alkoholreihe wird das Präparat entwässert Mit Uranylacetat, Phosphorwolframsäure, Bleiacetat oder Uranylformiat wird das Präparat kontrastiert Mit reinem Kunstharz (meist auf Epoxidbasis) erfolgt die Einbettung

8 Mikrotomschnitte Schnittdicken < 100 nm werden mit Ultramikrotomen hergestellt Mit Glas- (Anfänger) oder Diamantmessern (Profis) werden in die Apparatur eingespannt und schneiden das Präparat faltenfrei Die Schnitte werden im Messertrog gesammelt

9 Mikrotomschnitte

10 Zellwand einer Hefezelle (31.500fache Primärvergrößerung) Myelinscheide im Kleinhirn ( fache Primärvergrößerung) Chlamydomonas (5.000fache Primärvergrößerung) Rauhes ER (Chlamydomonas) (25.000fache Primärvergrößerung)

11 Negative Staining positive negative staining Herpesvirus Orthopockenvirus

12 Kryofixierung die Probe wird in der Druckkammer zwischen zwei Kupferplättchen gespannt in der Druckkammer wird die Probe bei 2000 bar und einer Temperatur von -192 C eingefroren die tiefgefrorene Probe wird in einem Vakuumbehälter im Hochvakuum mechanisch aufgebrochen an Luft würde an den kalten Bruchflächen sofort Wasserdampf kondensieren der Bruch erfolgt genau in der Mitte der Doppelmembranen, da zwischen den Fettsäuren der Membranen nur relativ schwache Wechselwirkungen auftreten im Vakuum wird Platin so verdampft, dass Pt- Atome in einem Winkel von 45 auftreffen anschließend wird reiner Kohlenstoff aufgedampft nach Auflösen der Probe im Säurebad wird der Abdruck mit Kohlenstoffverstärkung im TEM betrachtet

13 Kryofixierung die Probe wird in der Druckkammer zwischen zwei Kupferplättchen gespannt in der Druckkammer wird die Probe bei 2000 bar und einer Temperatur von -192 C eingefroren die tiefgefrorene Probe wird in einem Vakuumbehälter im Hochvakuum mechanisch aufgebrochen an Luft würde an den kalten Bruchflächen sofort Wasserdampf kondensieren der Bruch erfolgt genau in der Mitte der Doppelmembranen, da zwischen den Fettsäuren der Membranen nur relativ schwache Wechselwirkungen auftreten im Vakuum wird Platin so verdampft, dass Pt- Atome in einem Winkel von 45 auftreffen anschließend wird reiner Kohlenstoff aufgedampft nach Auflösen der Probe im Säurebad wird der Abdruck mit Kohlenstoffverstärkung im TEM betrachtet

14 Zellkern & Vakuole einer Hefezelle (25.000fache Primärvergrößerung) Vakuole einer Hefezelle (12.500fache Primärvergrößerung) Zellkern einer Hefezelle (proto- und extraplasmatische Bruchfläche) Plasmamembran von Hefezellen (li: proto-; re: extraplasmatisch)

15 Nomenklatur der durch Gefrierbruch freigelegten Membranflächen

16 Immuno-EM E.coli OmpA mit 15 nm Gold (40.000fache Primärvergrößerung) Saccharase-Isomaltase auf den Mikrovilli von Enterozyten mit 30 nm Gold (10.000fache Primärvergrößerung)

17 Raster- (Scanning-) Elektronenmikroskop (REM) wie beim Transmissions-Elektronenmikroskop wird auch beim REM der Elektronenstrahl von einer beheizten Kathode als Strahlungsquelle erzeugt im REM wird jedoch nicht das ganze Objekt ausgeleuchtet, sondern der Elektronenstrahl wird auf einen kleinen Punkt an der Oberfläche des Objekts fokussiert Das dabei entstehende Signal wird verstärkt und auf einer Bildröhre als Punkt abgebildet Ein Punkt auf dem Leuchtschirm der Bildröhre entspricht also einem Punkt auf der Oberfläche des Objekts Ein Rastergenerator führt den Elektronenstrahl des Mikroskops Punkt für Punkt über die Oberfläche des Objekts wobei auf dem Leuchtschirm ein Bild der Oberfläche entsteht Ein Vergrößerungseffekt entsteht dadurch, daß über dem Elektronenstrahl der Bildröhre ein stärkeres elektrisches Feld angelegt wird als über den Strahl im Mikroskop

18 Raster- (Scanning-) Elektronenmikroskop (REM) wie beim Transmissions-Elektronenmikroskop wird auch beim REM der Elektronenstrahl von einer beheizten Kathode als Strahlungsquelle erzeugt im REM wird jedoch nicht das ganze Objekt ausgeleuchtet, sondern der Elektronenstrahl wird auf einen kleinen Punkt an der Oberfläche des Objekts fokussiert Das dabei entstehende Signal wird verstärkt und auf einer Bildröhre als Punkt abgebildet Ein Punkt auf dem Leuchtschirm der Bildröhre entspricht also einem Punkt auf der Oberfläche des Objekts Ein Rastergenerator führt den Elektronenstrahl des Mikroskops Punkt für Punkt über die Oberfläche des Objekts wobei auf dem Leuchtschirm ein Bild der Oberfläche entsteht Ein Vergrößerungseffekt entsteht dadurch, daß über dem Elektronenstrahl der Bildröhre ein stärkeres elektrisches Feld angelegt wird als über den Strahl im Mikroskop

19 Raster- (Scanning-) Elektronenmikroskop (REM)

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