Zelldynamik. Methoden der Licht- und Elektronenmikroskopie

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1 Zelldynamik Methoden der Licht- und Elektronenmikroskopie

2 Dimensionen der Objekte biologischer Forschung Elektronenmikroskop Lichtmikroskop Auge kleine Moleküle Zellorganellen Zellen vielzellige Organismen Atome Makromoleküle

3 Einige wichtige Daten in der Geschichte der Lichtmikroskopie 1590 Johannes und Zacharias JANSSEN: Erfindung des Mikroskops? 1667 HOOKE prägt den Begriff ZELLE. um 1680 van LEEUWENHOEK entdeckt Einzeller, Spermatozoen und Bakterien. 1838/39 SCHLEIDEN (Pflanzen) / SCHWANN (Tiere) Alle Lebewesen sind aus Zellen und ihren Produkten aufgebaut: ZELLTHEORIE KÖLLIKER beschreibt Mitochondrien in Muskelzellen KOCH benutzt Anilinfarbstoffe zum Anfärben von Bakterien und identifiziert die Erreger von Tuberkolose und Cholera GOLGI beschreibt den Golgiapparat COONS benutzt Fluoreszenzfarbstoffe um subzelluläre Strukturen zu markieren CHALFIE und Mitarbeiter führen das green fluorescent protein (GFP) als Marker in der Lichtmikroskopie ein.

4 Robert Hooke prägte 1667 den Begriff Zelle Ein wichtiger Zeitgenosse von Robert Hooke war Antoni van Leeuwenhoek. Micrographia: or some physiological descriptions of minute bodies made by magnifying glasses with observations and inquiries thereupon. London: Printed for John Martyn, 1667.

5 Antoni van Leeuwenhoek um 1680: Antoni van LEEUWENHOEK entdeckt Einzeller, Spermatozoen und Bakterien. Bakterien aus dem Zahnbelag Leeuwenhoeks.

6 Theodor Schwanns und Matthias Schleidens Zelltheorie (1839) Alle Organismen bestehen aus einer oder mehreren Zellen Die Zelle ist die grundlegende Struktureinheit aller Organismen Schwann Schleiden

7 Rudolf Virchow (1855) "Omnis cellula e cellula": Alle Zellen entstehen aus Zellen Die Zelle als kleinste Einheit der Struktur und als kleinste Einheit der Vermehrung. In den folgenden Jahrzehnten wurde auch die Erkenntnis gewonnen, dass die Zelle auch die kleinste Einheit der Funktion des Lebendigen ist."

8 Camillo Golgi entdeckt den Golgi Apparat (1898) Golgi Apparat (internaler retikulärer Apparat) in einer Nervenzelle aus Maus Um diese Zeit waren auch schon Mitochondrien (Bioblasten), raues Endoplasmatisches Retikulum (granuläre Inseln) und sekretorsche Vesikel (Drüsenkörnchen) beschrieben. Man hatte jedoch noch kaum eine Idee von den Zusammenhängen zwischen Zellarchitektur und Zellfunktion.

9 Proben für die Lichtmikroskopie sind oft fixiert, dehydriert, geschnitten und gefärbt Nierengewebe Feulgen-Färbung; Chromosomen einer Wurzelspitzenzelle aus Zwiebel! Die Zellen sind tot. Artefakte!

10 Ungefärbte, lebende Zellen lassen sich durch Phasenkontrast und Nomarski-Interferenzkontrast sichtbar machen Hellfeld-Mikroskopie Phasenkontrast-Mikroskopie Differentielle Interferenz Kontrast (DIC) Mikroskopie

11 Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie kann man Proteine in Zellen spezifisch lokalisieren Primärer Antikörper: Kaninchen-Antikörper der spezifisch gegen das Protein X gerichtet ist. Sekundärer Antikörper: Ziege-Antikörper der spezifisch gegen Kaninchen-Antikörper gerichtetet und mit einem Fluorochrom gekoppelt ist. Protein X

12 Das Fluoreszenzmikroskop Okular Sperrfilter 2 Lichtquelle beam-splitting mirror Sperrfilter 1 Objektiv Probe Schematische Darstellung des Strahlenganges in einem Fluoreszenzmikroskop

13 Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie kann man Proteine in Zellen spezifisch lokalisieren 10 m grün: Mikrotubuli rot: Centromere blau: DNA (Chromosomen)

14 Green Fluorescent Protein (GFP) grün fluoreszierendes Protein GFP ca. 30 kda Bei Anregung mit blauem Licht (395 nm) zeigt das GFP eine grüne (510 nm) Fluoreszenz. Wurde aus der Qualle Aequorea victoria isoliert. Taggen von Proteinen mit GFP: GFP Gen wird mit dem Gen eines Proteins gekoppelt. Diese rekombinante DNA wird in Zellen transformiert. Die Zellen synthetisieren nun ein chimäres Protein welches sich in der Regel wie das wildtyp-protein verhält.

15 Green Fluorescent Protein (GFP) grün fluoreszierendes Protein Tubulin GFP rekombinante DNA Transformation in Zielzelle Tubulin Tubulin GFP Tubulin GFP Tubulin

16 Green Fluorescent Protein (GFP) grün fluoreszierendes Protein Zellkern

17 Moderne Entwicklungen in der Lichtmikroskopie 10. Deutschener Zukunftspreis 2006 Nobelpreis für Chemie 2014 Prof. Dr. Stefan W. Hell, MPI für Biophysikalische Chemie Göttingen STED-Mikroskopie (Stimulated Emission Depletion-Mikroskopie) Fluoreszenzbasierte Methode, eine Auflösung von 20 Nanometern kann erreicht werden.

18 STED-Mikroskopie Anregung Abregung Fluoreszenz Intensität Intensität Intensität nm nm nm 200 nm 20 nm 20 nm

19 STED-Mikroskopie Konventionelle konfokale Mikroskopie STED Mikroskopie Synaptische Vesikel Durchmesser der Vesikel ca. 40 nm

20 Einige wichtige Daten in der Geschichte der Elektronenmikroskopie RUSKA baut das erste Transmissions-Elektronenmikroskop VON ARDENNE baut das erste Rasterelektronenmikroskop 1939 SIEMENS & HALSKE produzieren das erste kommerzielle Transmissions- Elektronenmikroskop, das sog. Übermikroskop PALADE, PORTER und SJÖSTRAND u. A. entwickeln Methoden (chemische Fixierung, Ultradünnschnitt-Technik) mit deren Hilfe viele intrazelluläre Strukturen visualisiert werden können SINGER benutzt an Ferritin gekoppelte Antikörper um elektronenmikroskopisch spezifische Moleküle innerhalb von Zellen zu detektieren CAMBRIDGE INSTRUMENTS produziert das erste kommerzielle Rasterelektronenmikroskop DE ROSIER und KLUG entwickeln Techniken für die Rekonstruktion dreidimensionaler Strukturen aus elektronenmikroskopischen Aufnahmen CROWTHER, FULLER, FRANK bestimmen die Struktur von Viren und Ribosomen durch single-particle reconstruction. Entwicklung der Elektronen-Tomographie (versch. Arbeitsgruppen).

21 Transmissions-Elektronenmikroskop (-) (+) Kathode (Wolframdraht) Anode elektromagnetische Kondensorlinse Elektronenstrahl Probe Die Probe wird durchstrahlt. elektromagnetische Objetkivlinse elektromagnetische Projektorlinse Leuchtschirm Sehr dünne Schnitte sind nötig: Ultradünnschnitte mit einer Schnittdicke von ca. 60 nm. Das ist ca mal dünner als ein menschliches Haar.

22 Transmissions-Elektronenmikroskop Auflösungsvermögen Transmissionselektronenmikroskop: 0,1-0,2 nm Auflösungsgrenze des Transmissionselektronenmikroskopes: TEM - Bild einer sehr dünnen Goldschicht, individuelle Goldatome sind als helle Punkte zu erkennen.

23 Vergleich des licht- und elektronenmikroskopischen Auflösungsvermögens (Muskelgewebe) Lichtmikroskop Vergr. ca x Transmissions- Elektronenmikroskop Vergr. ca x Auflösung ca x besser als im Lichtmikroskop!

24 Probenpräparation für die Transmissions- Elektronenmikroskopie Präparation der Probe - Chemische Fixierung (Aldehyde, Osmiumtetroxid etc.), Entwässerung in Ethanol oder Aceton, Einbettung in Kunststoff - Kryofixierung (z.b. Hochdruckgefrierung), Gefriersubstitution ( Entwässerung ), d.h. Austausch Eis gegen Aceton bei sehr tiefen Temperaturen, Einbettung in Kunststoff - Kryofixierung ohne weitere Präparation Ultramikrotomie - Ultramikrotomie von in Kunststoff eingebetten Proben bei Raumtemperatur - Ultramikrotomie von kryofixierten, gefrorenen Proben (vitrifizierte Proben) bei C Analyse der Proben im Transmissionselektronenmikroskop - Elektronenmikroskopie bei Raumtemperatur (in Kunststoff eingebette Proben) - Kryoelektronenmikroskopie (Probe im TEM auf C gekühlt)

25 Chemische Fixierung und Einbettung einer Probe für die Transmissionselektronenmikroskopie Gewebestückchen (max. 1 mm 3 ) in erstem Fixans (Glutaraldehyd) Gewebestückchen in zweitem Fixans (Osmiumtetroxyd) 30 % Ethanol 50 % Ethanol 70 % Ethanol 95 % Ethanol 100 % Ethanol Fixierung Entwässerung Propylenoxid Infiltrierung mit Kunststoff (z.b. Epon) Probe in speziellem Gefäß mit Epon

26 Polymerisation Polymerisation des Kunststoffes im Wärmeschrank bei ca. 55 C zu einem harten Block an dessen Boden sich das Gewebe befindet.

27 Zuspitzen (Trimmen) des Kunststoffblockes. Trimmen

28 Ultradünnschnitte werden mit Hilfe von Ultramikrotomen und Diamantmessern angefertigt Ultradünnschnitte Diamantmesser

29 Ultramikrotomie Gewebeblock Ultradünnschnitte Messer Netzchen

30 Menschliches Haar, ca. 70 µm (1 µm : 1/1000 mm) Ultradünnschnitt ca. 60 nm (1 nm : 1/ mm) Ca mal dünner als ein menschliches Haar. Ein Nanometer entspricht in einem Stück Metall ungefähr einer Strecke von vier benachbarten Atomen.

31 Artifacts of Chemical Fixation: Mesosomes 400 nm - First reported in 1953 and for over 20 years cited as regularly occurring compounds of gram-positive bacteria. - Suggested to be involved in the synthesis of cell membranes, endospore formation, replication and segregation of DNA and energy production. Ebersold H.R., Cordier J.-L. and Lüthy P. (1981) Bacterial Mesosomes: Method Dependent Artifacts. Arch Microbiol 130:19-22

32 Artifacts of Chemical Fixation: Mesosomes 1 µm 1 µm 1 µm 1 % osmium tetroxide Mesosomes No osmium tetroxide No Mesosomes Mesosomes were recognized as artefacts of chemical fixation by the late 1970s, early 1980s. Dubochet J., McDowall A.W., Menge B., Schmid E.N. and Lickfeld K.G. (1983) Electron Microscopy of Frozen-Hydrated Bacteria. J Bact 155:

33 Probenpräparation für die Transmissions- Elektronenmikroskopie Präparation der Probe - Chemische Fixierung (Aldehyde, Osmiumtetroxid etc.), Entwässerung in Ethanol oder Aceton, Einbettung in Kunststoff - Kryofixierung (z.b. Hochdruckgefrierung), Gefriersubstitution ( Entwässerung ), d.h. Austausch Eis gegen Aceton bei sehr tiefen Temperaturen, Einbettung in Kunststoff - Kryofixierung ohne weitere Präparation Ultramikrotomie - Ultramikrotomie von in Kunststoff eingebetten Proben bei Raumtemperatur - Ultramikrotomie von kryofixierten, gefrorenen Proben (vitrifizierte Proben) bei C Analyse der Proben im Transmissionselektronenmikroskop - Elektronenmikroskopie bei Raumtemperatur (in Kunststoff eingebette Proben) - Kryoelektronenmikroskopie (Probe im TEM auf C gekühlt)

34 Kryofixierung durch Hochdruckgefrieren Fixierung der Proben durch sehr schnelles Einfrieren: Die Proben werden bei einem Druck von mehr als bar innerhalb von Millisekunden auf ca 170 C abgekühlt. (Abkühlrate mehr als C / sek.) Maximale Probendicke: 200 µm Im optimalen Fall: vitrifizierte Probe

35 Gefriersubstitution Die Entwässerung der Proben erfolgt bei niedrigen Temperaturen (- 90 C).

36 Whole mount Elektronenmikroskopie Herstellung der Präparate; Negativkontrastierung

37 Whole mount Elektronenmikroskopie: Bildentstehung

38 Whole mount Elektronenmikroskopie T4-Bakteriophage Verschiedene Typen von Bakteriophagen

39 Die dreidimensionale Struktur von Proteinen kann mit Hilfe der Röntgenstrahl-Kristallographie bestimmt werden Auflösung: unter 0,1 nm

40 Struktur des -Tubulindimers mit atomarer Auflösung Auflösung Röntgenstrukuranalyse: ca. 0,1 nm

41 Single-particle Kryo-Transmissionslektronenmikroskopie Mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie können makromolekulare Komplexe mit sehr hoher Auflösung dargestellt werden. Suspensionen von Partikeln werden auf dem EM-Netzchen eingefroren und im gefrorenen Zustand im sog. Kryo-Transmissionselektronenmikroskop analysiert. Auflösung Single-particle Kryo-Transmissionselektronenmikroskopie: 0,45 1,5 nm

42 Single-particle Transmissionslektronenmikroskopie Alpha-Untereinheit des 20S Proteasoms aus Thermoplasma acidophylum Negativkontrastierung

43 Bestimmung der dreidimensionalen Struktur von Proteinkomplexen durch single-particle averaging Rohdaten Rekonstruktion Röntgenstrukturanalyse: Auflösung ca.0.1 nm Modell 20S Proteasom: Auflösung ca. 1,1 nm

44 Kryo-Transmissionselektronenmikroskopische Bilder sind extrem kontrastarm Bakteriophage Epsilon15

45 Single-particle Kryo-Transmissionslektronenmikroskopie Mit Hilfe der Transmissionselektronenmikroskopie können makromolekulare Komplexe mit sehr hoher Auflösung dargestellt werden. 10 nm Die sieben Untereinheiten eines Bausteins des Kapsids von Epsilon15 Bakteriophage Epsilon15 Jiang et al., Nature, 2008 Auflösung: 0,45 nm

46 Dreidimensionale Darstellung von Strukturen mit Hilfe der transmissions-elektronenmikroskopischen Tomographie 1 µm Höög et al., Dev Cell., 2007 Pigino, Geimer et al., Dev Cell., 2009 Ansichten des Objektes aus verschiedenen Winkeln können zu einem dreidimensionalen Bild kombiniert werden.

47 Transmissions-Elektronenmikroskopische Bilder sind 2D-Projektionen einer 3D-Probe Elektronenstrahl 3D Struktur in Einbettungsmedium Elektronenstrahl 2D Bild

48 Eine einzige 2D Projektion eines Objektes ist nicht ausreichend, um Rückschlüsse auf dessen 3D Struktur zu ziehen 2D Projektionen eines Objektes aus verschiedenen Winkeln können zu einem dreidimensionalen Bild kombiniert werden: Tomographie

49 Das Prinzip der (Elektronen) Tomographie Von einem 3D Objekt wird eine grosse Anzahl von Bildern aus verschiedenen Winkeln aufgenommen Aus den aufgenommenen 2D Bildern kann eine 3D Ansicht des Objektes rekonstruiert werden

50 Elektronentomographie Aufnahme von Kippserien: Kippung der Probe im Elektronenmikroskop von -60 bis +60 in 1 Schritten 121 Ansichten / Aufnahmen der Probe aus verschiedenen Winkeln

51 Tomographie: Doppelkippung (dual axis tilt) Erste Kippserie: Kippung von -60 bis +60 in 1 Schritten 121 Aufnahmen der Probe Rotation der Probe um 90 Zweite Kippserie: Kippung von -60 bis +60 in 1 Schritte 121 Aufnahmen der Probe

52 Analyse von Serienschnitten 3 mm

53 Der Basalkörper C B A G tf 2 D E K A B C D E F G H I H tf 7 9 F J I tf Nachteil Serienschnitte: Durch die Schnittdicke begrenzte Auflösung in der Z-Achse dcf tf Maßstab: 250 nm

54 Elektronentomographie 1 60 nm 2 60 nm nm 60 nm 4 60 nm 4 Schnitte, je 60 nm 1 Schnitt, 240 nm

55 Elektronentomographie Golgi-Stacks in einer kutlivierten Pancreas-Zelle (Paul Walther, Universität Ulm)

56 Probenpräparation für die Transmissions- Elektronenmikroskopie Präparation der Probe - Chemische Fixierung (Aldehyde, Osmiumtetroxid etc.), Entwässerung in Ethanol oder Aceton, Einbettung in Kunststoff - Kryofixierung (z.b. Hochdruckgefrierung), Gefriersubstitution ( Entwässerung ), d.h. Austausch Eis gegen Aceton bei sehr tiefen Temperaturen, Einbettung in Kunststoff - Kryofixierung ohne weitere Präparation Ultramikrotomie - Ultramikrotomie von in Kunststoff eingebetten Proben bei Raumtemperatur - Ultramikrotomie von kryofixierten, gefrorenen Proben (vitrifizierte Proben) bei C Analyse der Proben im Transmissionselektronenmikroskop - Elektronenmikroskopie bei Raumtemperatur (in Kunststoff eingebette Proben ) - Kryoelektronenmikroskopie (Probe im TEM auf C gekühlt)

57 Kryo-Elektronenmikroskopie Fixierung der Proben durch schnelles Einfrieren und Kryoelektronenmikroskopie: keine chemische Fixierung keine Dehydrierung keine Einbettung in Kunststoff keine Kontrastierung (Fast) keine Artefakte! CEMOVIS: cryo-electron microscopy of vitreous sections

58 Kryofixierung durch Hochdruckgefrieren Dann jedoch keine Gefriersubstitution und Einbettung in Kunststoff, sondern: Kryoultramikrotomie

59 Kryo-Ultramikrotomie Ultramikrotomie bei niedrigen Temparaturen; der komplette Schneideraum ist auf -80 bis -140 C gekühlt. Technisch sehr aufwändig! Vitrifizierte Proben: Von 10 Proben lässt sich in der Regel eine gut schneiden.

60 Kryo-Transmissions-Elektronenmikroskopie Im Elektronenmikroskop wird die gefrorene Probe (-196 C) analysiert!

61 Kryo-Elektronentomographie Geißeln von Chlamydomonas Auflösung 5-8 nm 20 nm : ODA; outer dynein arms Konventioneller Dünnschnitt Nicastro et al., 2006

62 Kryo-Elektronentomographie Konventioneller Dünnschnitt radial spokes Nicastro et al., 2006

63 Kryo-Elektronentomographie Kernhülle mit Kernporen Beck et al., 2004

64 Kryo-Elektronentomographie Das Cytosol einer eukaryotischen Zelle (Dictyostelium) rot: Aktin blau: Membranen grün: Ribosomen etc.

65 Visual proteomics Beschreibung der Interaktionen von möglichst vielen Makromolekülen. Baumeister, 2006

66 Mit Hilfe der Immunogold-Elektronenmikroskopie können Proteine in Zellen mit sehr hoher Auflösung lokalisiert werden.

67 Bedampfung von Präparaten zur Kontrastierung

68 Tobacco Rattle Virus (Erreger der Rübenfleckigkeit) Negativkontrastierung Bedampfung mit Chrom

69 Tobacco Rattle Virus (Erreger der Rübenfleckigkeit) Bedampfung mit Chrom

70 Myosin, Bedampfung mit Platin

71 DNA, Bedampfung mit Platin

72 Gefrierbruch / Gefrierätzung

73 Gefrierbruch

74 Gefrierätzung

75 Gefrierbruch Zwiebelwurzelzelle

76 Gefrierbruch / Gefrierätzung; Geißeln eines Ciliaten. Alberts et al. 2003

77 Geißeln von Chlamydomonas Gefrierbruch Dünnschnitt

78 Rasterelektronenmikroskopie Modernes Rasterelektronenmikroskop.

79 Rasterelektronenmikroskopie Mit dem Rasterelektronenmikroskop erhält man ein Oberflächenbild der Probe. Die Auflösungsgrenze eines Standard-Raster- Elektronenmikroskopes liegt bei ca. 10 nm.

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83 Die Struktur des Kernporenkomplexes Cytoplasmatische Seite Nukleoplasmatische Seite 80 nm Die oktagonale Form des membranassoziierten Teils der Kernpore ist zu erkennen Der sogenannte nukleare Korb (nuclear basket) ist zu sehen. Hochauflösende Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme der Kernporen aus Xenopus Oocyten

84 Pollen Transmissions-Elektronenmikroskopisches Bild Raster-Elektronenmikroskopisches Bild