MIKROSKOPIE. Abbildung mittels Strahlenoptik. 3. Unterrichtseinheit

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1 # 95 MIKROSKOPIE 3. Unterrichtseinheit Abbildung mittels Strahlenoptik reelles verkehrtes Bild F Hauptebene (-)f (+)f (+)b F Konstruktion der Abbildung mit den 3 ausgezeichneten Strahlen: Mittelpunktstrahl bleibt Mittelpunktstrahl Parallelstrahl wird Brennstrahl (achsennahe Strahlen) Brennstrahl wird Parallelstrahl (achsennahe Strahlen) F F F - virtuelles aufrechtes Bild F F - (-) b (+) f (-) f (-) g

2 Lichtmikroskop einfachster Aufbau eines Mikroskops: Objektiv & Okular Objektiv: macht ein stark vergrößertes Zwischenbild (z.b. 40-fach vergrößert) dies wird dadurch bewerkstelligt, dass man den Gegenstand (G) nur wenig weiter als eine Brennweite (f) von der Linse entfernt aufstellt. (Je näher sich G am Brennpunkt befindet, desto größer wird die Abbildung) b b Betrachtet man den Mittelpunktsstrahl, erkennt man, dass die Vergrößerung VObjek. beträgt. g f Objek. Lichtmikroskop Okular: ist eine Lupe, mit der man das Zwischenbild betrachtet. Funktionsweise einer Lupe: Zuerst: Größtmögliche Betrachtung eines Gegenstands ohne Lupe: Der Winkel bestimmt die Größe des Bildes auf der Netzhaut. ist wiederum bestimmt durch die Entfernung Augenlinse Gegenstand. Wir sehen den Gegenstand unter dem Winkel. Könnten wir das Auge noch näher bringen, würde (und damit die Vergrößerung) noch größer werden =Nahpunkt

3 Lichtmikroskop Okular: ist eine Lupe, mit der man das Zwischenbild betrachtet. Funktionsweise einer Lupe: Normalerweise befindet sich bei einer Lupe der Gegenstand in Brennweiten-Entfernung von der Linse. Der Winkel (und damit die Größe des Bildes auf der Netzhaut) wird ausschließlich von der Lupen-Brennweite bestimmt! Die Lupe verursacht nur dann eine Vergrößerung, wenn f Lupe <25cm. Das Bild erscheint uns so groß, als befände sich unser Auge selbst an der Position der Lupe. V Lupe 25cm f Lupe in cm! Lichtmikroskop V ges V Objek. V Okular f b Objek. x f N Lupe f xn f Objek. Lupe x N Nahpunkt (ca. 25 cm)...tubuslänge=abstand zwischen den benachbarten Brennpunkten von Objektiv und Okular Da die Brennweite des Objektivs üblicherweise sehr kurz ist (mm), gilt b

4 Auflösungsvermögen Objektiv x min n : sin N A n Verbesserung des Auflösungsvermögens: durch kleinere Wellenlänge Verwendung von Wasser / Immersionsöl Pro b e inkohärente Beleuchtung: (gleichzeitige Beleuchtung aus mehreren Richtungen) x min 2 N A Vergrößerung Faustregel: Die mit Lichtmikroskopen erreichbare Auflösung beträgt etwa x min 2

5 Vergrößerung Mit Linsen könnte man praktisch beliebig stark vergrößern. Das Problem ist, dass die Auflösung nicht beliebig verbessert werden kann! Es existiert deshalb eine maximale sinnvolle Vergrößerung ( förderliche Vergrößerung ). Darüber hinausgehende Vergrößerung bringt nichts mehr! ( leere Vergrößerung ) Erreichbare förderliche Vergrößerungen mit dem Lichtmikroskop: ca fach Typische Objektgrößen: Bakterien: 1 μm 2 μm ( fache Vergrößerung notwendig) Viren: 20 nm 60 nm ( fache Vergrößerung notwendig) Große Atome: 0.1 nm ( fache Vergrößerung notwendig) Beleuchtung Köhlersche Beleuchtung Die Probe sollte möglichst gleichmäßig ausgeleuchtet sein! Köhlersche Beleuchtung Leuchtfeldblende Aperturblende Probenebene Kollektor sammelt das Licht der Wendel Kond e nsor verdichtet das Licht am Ort der Probe

6 Beleuchtung Köhlersche Beleuchtung Anderes Strahlenbündel. Zeichnet man alle Strahlenbündel ein, die von der Glühwendel ausgehen, erhält man in der Probenebene einen Beleuchtungskegel Leuc htfeldblende Aperturblende Probenebene Kollektor sammelt das Licht der Wendel Ko nd e nso r verdichtet das Licht am Ort der Probe Beleuchtung Köhlersche Beleuchtung Beleuchtungskegel Kondensor

7 Beleuchtung Köhlersche Beleuchtung Einfluss der Aperturblende: Sie bestimmt die Apertur (=Öffnungswinkel) des Beleuchtungskegels. (z.b.: Kegel wird (annähernd) zum Zylinder, wenn die Aperturblende ganz zu ist) Durch Vergrößern der Apertur kann man die Auflösung um bis zu Faktor 2 verbessern, allerdings kann sich der Kontrast dabei verschlechtern Le uc htfeldblende Aperturblende Einziges Strahlenbündel, dass Durch die Aperturblende passt Ko llekto r Ko nd enso r Beleuchtung Köhlersche Beleuchtung Einfluss der Leuchtfeldblende: Sie bestimmt die Größe des ausgeleuchteten Bereichs z.b.: Leuchtfeldblende weit offen: Le uc htfeldblende Aperturblende Le uc htfe ld Kolle kto r Kond enso r

8 Beleuchtung Köhlersche Beleuchtung Einfluss der Leuchtfeldblende: Sie bestimmt die Größe des ausgeleuchteten Bereichs z.b.: Leuchtfeldblende fast ganz zu: Leuchtfeldblende Aperturblende Leuchtfeld Kollektor Ko nd e nso r Kritische Beleuchtung Hier wird die Lichtquelle direkt in die Probenebene abgebildet Nachteil: Lichtquelle muss homogen sein Kondensor

9 Durchlicht / Auflicht Auge Okular Objektiv Objektträger Kondensor Lichtquelle Lichtquelle Auge Okular Strahlteiler Objektiv = Kondensor Objektträger Dunkelfeld-Mikroskopie Das ungebeugte Beleuchtungslicht verfehlt die Objektivlinse Beleuchtungs- Kegelmantel k x,k y x,y Objekt Objektiv Dunkelfeldbild

10 Kontrast monochromatische Beleuchtung: Helligkeitsunterschiede Kontrast I I max max I I min min polychromatische Beleuchtung ( Weißlicht ): Farbunterschiede Kontrast Amplitudenobjekt (Seitenansicht) durch unterschiedliches Absorptionsvermögen (Lichtmikroskop) Phasenobjekt (Seitenansicht) durch unterschiedliche Dicke oder unterschiedlichen Brechungsindex

11 Kontrast Lichtwelle durchdringt ein Objekt Kontrast Wie kann man den Kontrast verbessern? Selektiv bestimmte Strukturen mit fluoreszierenden Stoffen (z.b. GFP) anfärben und zum Leuchten anregen Fluoreszenzmikroskopie Spiegel Lampe Anregungslicht Monochromator Okular Auge Monochromator halbdurchlässiger Spiegel Fluoreszenzlicht Objektiv Präparat Objektträger

12 Kontrast Wie kann man den Kontrast verbessern? Man kann über Interferenz die unterschiedliche Phasenlagen von Licht in Intensitätsunterschiede umwandeln Phasenkontrast Die zwei Wellen haben gleiche Amplitude, jedoch unterschiedliche Phase. Man kann den Sprung im Objekt nicht erkennen! Objekt Kontrast Wie kann man den Kontrast verbessern? Man kann über Interferenz die unterschiedliche Phasenlagen von Licht in Intensitätsunterschiede umwandeln Phasenkontrast Interferenz Objekt Es ergeben sich Intensitätsunterschiede, die Mit dem Auge erkennbar sind!

13 Kontrast Phasenkontrast-Methoden Phasenkontrast: direktes Licht (um /4 verschoben) und gebeugtes Licht zur Interferenz bringen Beleuchtungsring Objekt /2-Phasen-Schieber Phasenkontrast-Bild Kontrast Phasenkontrast-Methoden DIC (Differential Interference Contrast) Auge Okular Analysator Aufteilen in 2 Teilstrahlen durch doppelbrechende Wollaston - Prismen doppelbrechendes Wollaston-Prisma Objektiv Objektträger Kondensor doppelbrechendes Wollaston-Prisma Polarisator

14 Kontrast Polarisations-Kontrast Es gibt auch Proben, welche die Polarisation des Lichts beeinflussen. Unterschiede in der Polarisationsrichtung sieht man im Polarisations- Kontrast-Verfahren. untersuchtes Objekt zwischen zwei gekreuzten Polarisationsfiltern Auge Okular Polarisationsfilter 1 Objektiv Objektträger Polarisationsfilter 2 Lichtquelle Nur wenn die Probe die Polarisation beeinflusst (z.b. dreht), kommt Licht durch den zweiten Polarisator Polarisationsunterschiede werden in Intensitätsunterschiede umgewandelt Andere Mikroskopie-Methoden

15 Konfokale Mikroskopie 3 Tricks : konfokales Prinzip mit stark fokussiertem Licht nur winzigen Bereich des Objekts beleuchten Lochblenden filtern Licht aus falschen Schichten weg Abtasten des Präparats (= Rasterung = Scanning) Vorteil: verbesserte Aufllösung Brennebene Brennebene Brennebene Strahlteiler Strahlteiler Strahlteiler Objektiv Brennpunkt für Strahlen HINTER der Brennebene Objektiv Brennpunkte für Strahlen VOR der Brennebene Objektiv Probenschicht Brennebene Probenschicht Brennebene Probenschicht Brennebene Nahfeld-Mikroskopie Man kann Licht auch durch eine Öffnung mit Durchmesser < quetschen. Allerdings dämpft nach der Öffnung das Lichtfeld stark aus (exponentiell). Bringt man die Öffnung (z.b. Glasfaserspitze) sehr nahe (<) an das Objekt heran, kann man winzige Bereiche der Probe ausleuchten. Vorteil: Auflösung <100nm möglich! Nachteile: geringe Lichtausbeute Objekt muss abgerastert werden

16 Raster-Kraft-Mikroskop auch: Atomic Force Microscope (AFM) wie Nano-Plattenspieler mit Spitze Oberfläche abtasten: Auslenkung über Laserstrahlablenkung messen Abbildung bezieht sich auf den Kontaktmodus, bei dem der Cantilever die Probe auch wirklich berührt. Es gibt auch einen Nicht- Kontakt Modus Raster-Tunnel-Mikroskop auch: Scanning Tunneling Microscope (STM) Tunnelstrom sehr empfindlich auf Abstands-Änderung hohe Auflösung! Nachteile: Oberfläche muss elektrisch leitend sein Abrasterung nötig Elektronen können eigentlich unüberwindbaren Spalt überbrücken Tunneleffekt d (bis 0.1 nm)

17 Raster-Tunnel-Mikroskop Fehlstelle in einem Kristall Elektronenmikroskop Der Welle-Teilchen-Dualismus gilt für jede Art von Teilchen, auch für Elektronen! Wellenlänge Elektron (DeBroglie-Wellenlänge) db h p h m v h Planck sches Wirkungsquantum p Impuls des Elektrons m Masse des Elektrons V Geschwindigkeit des Elektrons Elektronen-Wellenlängen können sehr viel kleiner sein als Lichtwellenlängen! (<1 nm) Dementsprechend ist die mögliche Auflösungsgrenze auch viel kleiner!

18 Elektronenmikroskop Strahlerzeugung Heizwendel Wehneltelektrode in Joule (J) 2 p E kin eu 2m Ladung des Elektrons: e=1.6*10-19 C C... Coulomb (Einheit der Ladung) U in Volt einsetzen! 0 + Äquipotentiallinien Beschleunigungselektrode Elektronenbahnen + Beispiel Welche Auflösung ist bei einem ELMI theoretisch möglich, wenn die Elektronen mit 20 kv beschleunigt werden? gegeben: h, Masse und Ladung des Elektrons (m e, q e ) zuerst den Impuls des Elektrons ausrechnen: E kin 2 p eu p 2meU 2m Dann die Wellenlänge des Elektrons berechnen: db h p h 2meU Die Auflösungsgrenze ist (wie beim Lichtmikroskop) etwa /2

19 Elektronenmikroskop Abbildung Abbildungen erfolgen mit elektrischen oder magnetischen Feldern Elektrische Felder Magnetische Felder Elektronenmikroskop Auflösungsgrenze höhere Geschwindigkeit kürzere Wellenlänge bessere Auflösung U db xmin [V] [nm] [nm] ,0087 0, ,0043 0, , ,10 der Gewinn an Auflösungsvermögen im Vergleich zum Lichtmikroskop ist geringer, als man es sich von der Verkleinerung der Wellenlänge erwarten könnte, aufgrund der ausgeprägten Linsenfehler im Elektronenmikroskop

20 Transmissions-ELMI Abbildung ähnlich wie beim Lichtmikroskop mit magnetischen Linsen Objekt: nm dicke Schicht auf Objektträger Elektronen werden gestreut Nachteile: Aufwändige Probenpräparation (Kontrastmittel) Probe muss gegen Elektronenstrahl widerstandsfähig sein TEM mit magnetischen Elektronenlinsen Kathode Wehnelt-Elektrode Kondensor Beschleunigungsu. Fokussierelektrode Objekt im Objekt gestreute Objektiv Elektronen Projektiv (entspricht Okular beim Lichtmikroskop) Zwischenbild Leuchtschirm sichtbares Bild Raster-ELMI stark fokussierter Strahl tastet Probe zeilenweise ab; aus dem Material austretende Sekundärelektronen werden zur Bildgebung verwendet

21 Raster-ELMI Probenanalyse: gestreute Sekundärelektronen registrieren (Elektronendetektor) Reliefstruktur der Probenoberfläche charakteristische Röntgenstrahlung messen Röntgenspektrum der Probe (Konzentrationsverteilungsbild eines bestimmten chemischen Elements lässt sich herausfiltern) Überblick Mikroskopie-Methoden lasergestützte M. Fluoreszenz-M. LSM SNOM Nahfeld-M. AFM STM TEM REM Scanning-M. (Raster-M.) Elektronen-M.

22 Auflösung & Vergrößerung Funktionsweise Anwendungsbereiche Vor- und Nachteile Licht- Mikroskop optische Abbildung mit Licht 200 nm Gewebe-schnitte, Zellen etc. begrenztes Auflösungsvermögen Ultraschall- Mikroskop optische Abbildung mit Schall 0,5 m (bei 3 GHz) Materialprüfung (Halbleiter, mikroelektron. Schaltkreise) Kontrast durch elastische (!) Eigenschaften konfokales LSM 3D-Schichtbilder erstellbar etwas besser als Lichtmikroskop: 100 nm dicke (!) transparente Proben (von Neurologie bis Computerchips) Kontrast nicht invasiv SNOM optisches Nahfeld 100 nm Einzel-Moleküle, Lokalisation markierter Antikörper gewebeschonend; kombinierte Information (Ort + Fluoreszenz); Artefakte? TEM REM Durchstrahlung mit Elektronen Sekundärelektronen 0,2 nm nm nm Schnitte, kl. Partikel auf dünnen Membranen behandelte Oberflächen hohe Auflösung aufwändige Gewebepräparation Ultrahochvakuum AFM Ablenkung einer Raster- Spitze 0,1 nm Atomgitter, Moleküle, Zellen, Chromosomen, etc. hohe Auflösung Vielseitig STM Tunnelstrom 0,01 nm Festkörperoberflächen (z.b. Halbleiterund Oxidschichten) nur elektrisch leitende Festkörperoberflächen

23 Beispiele Welche Aussagen über das STM sind richtig? Die Probe muss abgescannt werden Die Oberfläche der Probe muss elektrisch leitend sein Die Auflösung ist durch die Wellenlänge der Elektronen bestimmt Beispiele Durch die Köhlersche Beleuchtung erreicht man eine homogen ausgeleuchtete Probenebene DENN jeder Punkt der Lichtquelle wird auf einen Punkt in der Probenebene abgebildet Aussage 1 und 2 richtig, aber Verknüpfung falsch Aussage 1 richtig, Aussage 2 falsch Aussage 2 richtig, Aussage 1 falsch

24 Beispiel welcher Strahlengang ist falsch?