Southern Blot, in-situ Hybridisierung, (quantitative) PCR. Northern Blot, Quantitative RT-PCR, DNA-Chip

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1 Molekularbiologie Proteinnachweis, -quantifizierung Western Blot, Immunhistochemie DNA Nachweis / Quantifizierung Southern Blot, in-situ Hybridisierung, (quantitative) PCR RNA Quantifizierung Northern Blot, Quantitative RT-PCR, DNA-Chip Mutationsanalyse RFLP, Sequenzierung, Schmelzpunktanalyse, Hybridisierung Deletionsanalyse PCR, Sequenzierung Translokationsanalyse Southern Blot, (RT-)PCR, FISH

2 Detektion von DNA / RNA Keine Aussage über Lebens- oder Vermehrungsfähigkeit Keine Screeningmethode Viren (ev. integriert) Bakterien Parasiten Hohe Sensitivität

3

4 In-situ Hybridisieung HPV 16/18

5 Durchführung - PCR Amplifikation Trennung der Produkte nach Größe Identifizierung und Analyse

6 Amplifikation

7 Trennung der Produkte nach Größ öße

8 Identifizierung und Analyse

9 HPV 18 - PCR

10 Nachweis von Erreger-DNA mittels PCR Vorteile Nachteile Unkultivierbare Organismen Zeitfaktor Hohe Sensitivität Aufwand Kontaminationsgefahr (falsch positive Ergebnisse) Keine Screeningmethode

11 Quantifizierung von DNA/RNA Blot: Southern/Northern (RT)PCR: (Semi-)quantitative in situ -Methoden (z.b.: FISH) Chip-Verfahren (high throughput) Seltener verwendet: Nuclease protection assay, Ligase chain reaction etc.

12 Quantitative PCR: Exonuclease probe Polymerization R = Reporter Q = Quencher Forward Primer R Probe Q 5' p3' 3' 5' 5' 3' 5' Reverse Primer Strand displacement R 5' p3' 3' 5' 5' 3' 5' Q Cleavage R 5' p3' 3' 5' 5' 3' 5' Q Polymerization completed R Q p 3' 5' 3' 5' 5' 3' 5'

13 Quantifizierung von N-myc

14 Expressionsanalyse I. Northern Blot - One Gen at a time II. cdna Macroarray Gene auf einer Membrane (8x12 cm) III. cdna Microarray (DNA Chip) - z.b. vollständiges Saccharomycesgenom (6116 Gene/cDNAs) auf einem Objektträger (2x2 cm)

15 Normale Mucosa Karzinom mrna mrna Cy 5 - markierte cdna Cy 3 - markierte cdna Hybridisierung cdna array Scanner

16 Hybridisierter cdna-array Vergleich zweier Lymphom-Zelllinien

17 RNA expression analysis KM-H2 IgG3 KM-H2 Ki-1 KM-H2 no K299 Ki-1 K299 IgG3 K299 no no IgG3 Ki-1 no IgG3 Ki-1 KM-H2 K299 Hodgkin signature DNA content cell cycle apoptotic cells cdna microarray experiments Analysis Identification of CD30 controlled genes RQ-PCR validation ALCL signature

18 Analyse von Punktmutationen Methoden: Restiktionsenzymanalyse Hybridisierung DGGE SSCP Allelspezifische PCR Sequenzierung

19 Molekulare Diagnostik Gerinnungsstörungen, Stoffwechselerkrankungen Faktor V Leiden Mutation Hämochromatose: HFE-Gen Mutationen Mb. Wilson: ATP7B - Mutationen

20 Mutation Faktor V Leiden Häufigste genetisch bedingte Ursache für venöse Thrombosen Prävalenz: 5-7% in der Normalbevölkerung Mutation: G1691A = Arg561Gln

21 MnlI Faktor V Leiden

22 Mutationsanalyse DNA-Polymorphismen: z.b. Hämochromatose Verwendung unterschiedlicher Analysetechniken Restriktionsenzymanalyse Schmelzpunktanalyse (Real-time PCR) Hybridisierung (Strip-Assay)

23 Mutation C282Y des HFE-Gens: RFLP-Analyse St + - Kontr. Patient

24 Mutation C282Y des HFE-Gens: Schmelzpunktanalyse

25 Translokationsnachweis - Techniken Zytogenetik Molekularbiologie Southern Blot PCR RT-PCR FISH (Fluoresezenz in situ Hybridisierung)

26 Translokation BCR-ABL

27 Nachweis BCR-ABL mittels RT-PCR

28

29 FISH BCR- ABL

30 Anwendungen Diagnostik: CML Individuelle Risikoabschätzung: AML, ALL Therapiekontrolle: KMT, (Chemotherapie, Interferon) Früherfassung eines Relaps

31 B-Lymphozyten B-Zell Rezeptor Effektorzellen: Plasmazellen - Antikörperproduktion Unterstützung des Makrophagensystems

32 Immunglobuline Glykoproteine, im Serum u. Gewebsflüssigkeiten aller Säugetiere AG-Rezeptoren: an Zelloberfläche AK: frei im Blut oder Lymphflüssigkeit 5 Klassen: IgG, IgA, IgM, IgD, IgE Unterschiede: Größe, Ladung, AA- Zusammensetzung, Kohlehydratgehalt

33 Genstruktur

34 TCR-ß Gen-rearrangement Addition of a variable number of nucleotides in a template independant fashion N - region

35 Hypervariable Regionen CDR (complementarity determining regions) Jede Leicht- und Schwerkette: 3, CDR1- CDR3 Umgeben von 4 FR (framework regions) CDR's aufgrund von Faltung nahe aneinander

36 Bestimmung der Klonalität Unterscheidung von reaktiven (polyklonalen) und neoplastischen (monoklonalen) Prozessen Zuordnung zur B- oder T-Zellreihe Unterscheidung von Rezidiven und Zweittumoren Immunglobulin Schwerketten Gen T-Zell Rezeptor-γ-Ketten Gen

37 Reaktiv? CLL?

38

39 IgH PCR - Klonalitätsbestimmung

40 Lymphom?

41 TCRγ

42 Analysis of PCR products Method Comparison TCRγ -PCR Patient PAGE analysis Capillary electrophoresis

43 Verlaufskontrolle nach KMT Analyse des X-Chromosoms RFLP VNTR Minisatelliten Mikrosatelliten STR Short Tandem Repeats

44 Loci: Größe (bp): D8 S D21 S Patientin vor KMT D18 S STR-Analyse Spenderin Farbstoff: JOE Patientin 6M nach KMT, peripheres Blut Patientin 6M nach KMT, Beckenkamm 60% Spenderzellen <10% Spenderzellen

45 Molekulare Diagnostik - Onkologie Nachweis der: Amplifikation von Onkogenen Mikrosatelliteninstabilität Punktmutationen (Onkogene, Tumorsupressorgene) Klonalität

46 N-myc Southern-blot 1,2: pos. Ko. (IMR) 3,4: normale DNA 5: Patient 1 6: Patient 2, 10μg 7: Patient 2, 5μg 8: Patient 2, 2μg DNA

47 Quantitative PCR N-myc

48 HNPCC Hereditary Non- Polyposis Colon Carcinoma Junge Patienten Colon ascendens Muzinöses Adenokarzinom Mutation in DNA-Reparaturgen (hmsh2, hmlh1, hpms1, hpms2) Hohe Mutationsrate Mikrosatelliteninstabilität

49 HNPCC MSI- Analyse 6-FAM BAT 25: bp D2 S123: bp TET BAT 26: bp D17 S250: bp HEX D5 S346: bp TAMRA Interner Standard BAT26 D5 S346 BAT 25 (APC) D17 S250 (Mfd 15CA) D2 S123 Normalgewebe Tumor: MSS

50 HNPCC MSI-Analyse BAT 25 BAT2 D5 S346 (APC) 6 D5 S346 (APC) Interner Standard NORMALGEWEBE NORMALGEWEBE TUMORGEWEBE: MSI-H TUMORGEWEBE: MSI-H

51 Zusammenfassung Fragestellung: Diagnostik, individuelle Risikoabschätzung, Krankheitsausbreitung, Therapiekontrolle, Früherfassung eines Relaps Methodenwahl: Zytogenetik, Southern-Blot, PCR, RT-PCR, quantitative PCR, Sequenzierung Ausgangsmaterial: Abhängig von Methode

52 Perspektiven Evaluierung vorhandener Marker Relevanz bei individueller Risikoabschätzung Relevanz bei minimal residual disease Kostenfrage Etablierung neuer Marker Standardisierung Neue Techniken: z.b.: Expressionsanalyse (RNA, Protein)