Typisierung equiner Rotaviren

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1 Typisierung equiner Rotaviren Mandy Elschner 1, Christina Schrader 2, Helmut Hotzel 1, Peter Otto 1 1 FLI, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, IBIZ, Standort Jena 2 Bundesinstitut für Risikobewertung, Berlin Rotavirusinfektion des Fohlens Erstmalig in England 1975 beim Fohlen nachgewiesen Inkubationszeit 24h bis 48h Klinik: Durchfall-Kotkonsistenz von normal bis wässrig gelb oder grau Subklinische Verläufe bis schwere Durchfälle mit Dehydratation Saug- und Freßunlust Depressionen, Konditionsverlust Alter der erkrankten Fohlen Tage, durchschnittlich Tage Verläufe mit schwerer wässriger Diarrhoe häufiger bei Fohlen < 30 Tage Verläufe mit transienter Anorexie und Fieber häufiger bei Fohlen > 120 Tage Dauer des Durchfalls 2-12 Tage, durchschnittlich 2,3 Tage Ausscheidung beginnt 2 Tage vor Einsetzen des Durchfalls, Dauer 2-6 Tage 1

2 Bedeutung der Rotaviren für Durchfallerkrankung des Fohlens USA Roberts et al., 1990 Rotaviren in > 50% der Proben (n = 493) kranker Fohlen Japan Imagawa et al., , Rotaviren in 28% der Proben (n = 601) kranker Fohlen Deutschland Eichhorn et al., , Rotaviren in 15% der Proben (n = 26) kranker Fohlen G- und P- Typen von equinen Rotaviren Japan Tsunemitsu et al., : 86% G-Typ 3 (n=26), 1997: 53% G-Typ 14 (n= 36) Australien Browning et al., Rotavirus-positive Kotproben aus 22 Beständen: 87% G3 P[12] 13% G14 P[12] England Isa et al., % G3 P[12] 14% G14 P[12] (n= 121) 1x G13P[18] 2x G10P[1] 1x G8P[1] 1x G5P[7] 2

3 Untersuchungen an 26 Rotavirus-positiven Kotproben von durchfallkranken Fohlen aus 12 Gestüten: Probennummer (Bestand) Jahr 4615*, 4616*(A) * (B) (C), 4696, 4698*, 4699, 4700 (D), 4702* (E) * (F), 00V0021* (G), 00V0023 (H), 00V0033* (C) V0045, 00V0049, 00V0051, 00V0055 (C), 00V0056 (I) V0016 (C) V0146 (J), 01V0147, 01V0148, 01V0149 (C) V0227 (K) V0313, 02V0315 (L) 2002 * Rotavirusisolate RNA Segment PAGE Protein VP4 P-Typisierung 1 VP VP 2 VP 3 VP 4 5 NSP 1 6 VP NSP 2 NSP 3 VP 7 10 NSP 4 VP7 G-Typisierung 11 modifiziert nach Estes, 1996 NSP 5 Bisher: 15 G-Typen und 21 P-Typen 3

4 I Analyse der viralen RNA Nicht- equines RNA- Profil Porcines RV Bovines RV Equines RNA-Profil Equine Rotaviren 1 2/ /8/ / /8/

5 II Bestimmung des G- und P-Genotypes PCR DNA- DNA- Hybridisierung Sequenzierung G-Typisierung equiner Rotaviren A) One-Step RT- PCR: Amplifikation des kompletten Gensegments 9 A B C D E F Beg bp End 9 C) Sequenzierung von 5 Isolaten B) semi-nested Amplifikation A B C D E F G14 G 3 End bp 582 bp (Primer nach Tsunemitsu et al. 2001) 5

6 Ergebnisse der G-Typisierung equiner Rotaviren mit PCR Von 26 Kotproben: in 22 Fällen Rotaviren vom G-Typ 3 in 4 Fällen Rotaviren vom G-Typ 14 Ergebnis der Typisierung von 8 equinen Rotavirusisolaten: 500bp bp 582bp 374bp 1 100bp-Marker 2 G14-Ref. stamm FI23 3 G3-Ref. stamm H2 4 00V0021F1 5 00V0033E F G G G G G7 12 n.k. Nucleotid- und Aminosäuresequenzhomolgie des VP7-Gens der equinen Rotavirusisolate % Homologie AS Sequenz Strain 4616G G5 4766G3 4775G7 4702G1 4616G11 98,8 98,2 99,1 87,7 4698G5 97,1 97,2 99,1 87,1 4766G3 97,6 96,3 97,5 87,4 4775G7 96,6 99,1 95,8 87,1 4702G1 82,9 83,1 83,2 82,8 % Homologie NT Sequenz 6

7 % Homology of the coding region of VP7 (1007nt, 326 aa) Nucleotide sequences Amino acid sequence Strain* G-type 4616G G7 4698G5 4766G3 4702G1 4616G G7 4698G5 4766G3 4702G1 KU S H2 3 98, FI Gottfried OSU NCDV Ch HMG Bulumkutu A YM L L FI Hg P-Typisierung equiner Rotaviren A) One-Step RT- PCR: Amplifikation des partiellen Gensegments 4 von P[12]- Referenzstamm FI23 und 5 Rotavirusisolaten con3 V con2 V V 877 C) Sequenzierung von 5 Isolaten B) 2. Amplifikation: variabler Bereich EQ4Cs 504 bp EQ4FIas Gel-Extraktion DIG-Markierung P[12]-Sonde 7

8 Untersuchungen zur P[12]- Genotypspezifität der Sonde P-Genotyp ERV-H1 ERV-FI23 ERV-L338 ERV-FI14 ERV-H2 BRV-NCDV BRV-UK BRV-B223 CRV-CU1 HRV-Wa HRV-AU1 PRV-Gottfr. PRV-OSU Partielle VP4-Gene: RT-PCR mit con2-con3 877 bp Southern-Blot u. Hybridisierung mit P[12]-Sonde Ergebnisse der P-Typisierung equiner Rotaviren mit DNA-Sonde Von 26 Kotproben: in 26 Fällen Rotaviren vom P-Typ [12] Ergebnisse der Typisierung von 8 equinen Rotavirus- Isolaten P-Genotyp G3 4775G7 4702G1 00V0033E2 00V0021F1 4515F4 4616G G5 FI23 FI14 H2 Partielle VP4-Gene: RT- PCR mit Primern con2- con3 877 bp Southern-Blot u. Hybridisierung mit P[12]-Sonde 8

9 Nucleotid- und Aminosäuresequenzhomolgie des VP4-Gens der equinen Rotavirusisolate % Homologie AS Sequenz Stamm 4616G G5 4702G1 4766G3 4775G7 4616G11 98,3 97,7 97,0 97,3 4698G5 95,4 98,7 98,0 99,0 4702G1 97,2 95,5 98,0 97,7 4766G3 95,2 95,7 95,3 97,0 4775G7 95,5 99,2 95,4 95,8 % Homologie NT Sequenz % Homology in a 898 bp region (299aa) of VP4 genes of equine rotavirus isolates Nucleotide sequence Amino acid sequence Strain* P-type 4616G G5 4702G1 4766G3 4775G7 4616G G5 4702G1 4766G3 4775G7 NCDV SA CU L UK Gottfried OSU Wa AU M B FI H FI MDR HAL Lp EDIM PO L F EHP Hg

10 Zusammenfassung Die etablierte Methode zur P-Typisierung mittels DNA-Sonde weist eine hohe Spezifität auf. In 26 Rotavirus-positiven Kotproben von Fohlen wurde 22 mal (84,6%) der Typ G3 P[12] und 4 mal ( 15,4%) der Typ G14 P[12] nachgewiesen. Der dominierende Genotyp bei den equinen RV ist G3 P[12]. Bei den equinen RV scheint der P-Typ konservierter, als bei Rotaviren anderer Spezies zu sein. Vielen Dank für die Bereitstellung der Proben Dr. Werner Eichhorn, LMU, München Dr. Werner Herbst, JLU, Giessen für die technische Assistenz Jutta Prudlo 10