Nukleinsäure-basierte Diagnostik in der Veterinärmedizin im Wandel - das Labor von gestern bis heute

Transkript

1 Nukleinsäure-basierte Diagnostik in der Veterinärmedizin im Wandel - das Labor von gestern bis heute Helmut Hotzel, Institut für bakterielle Infektionen und Zoonosen, Jena

2 Friedrich-Loeffler-Institut (FLI) Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit 11 Fach-Institute an 7 Standorten: Hauptsitz Insel Riems: Braunschweig: Celle: Jena: Mariensee: Tübingen: Wusterhausen: Institut für Molekularbiologie Institut für Virusdiagnostik Institut für Infektionsmedizin Institut für neue und neuartige Tierseuchenerreger Institut für Tierernährung Institut für Tierschutz und Tierhaltung Institut für bakterielle Infektionen und Zoonosen Institut für molekulare Pathogenese Institut für Nutztiergenetik Institut für Immunologie Institut für Epidemiologie

3 Standort Jena des FLI - Institut für bakterielle Infektionen und Zoonosen - Institut für molekulare Pathogenese - 15 Nationale Referenzlaboratorien - 3 OIE-Referenzlaboratorien u. a. - Brucellose - Psittakose - Rotz - Vibrionenabort der Rinder

4 Veterinärmedizinische Diagnostik umfasst eine Vielzahl unterschiedlicher Gebiete zur Identifizierung von Krankheitsursachen bei Tieren. Hier: Molekularbiologische Diagnostikmethoden zum Nachweis und zur Typisierung von tierpathogenen Krankheitserregern wie Bakterien, Pilzen, Viren über DNA bzw. RNA

5 Mikrobiologie Serologie Molekularbiologie Anzucht Antikörpernach- Nachweis über Nu- Phänotypisierung weis nach Erreger- kleinsäuren biochem. Charak- kontakt Genotypisierung terisierung Blutuntersuchung incl. Feintypisierung keine Anzucht nötig viele Erreger Antikörper nur mit steht der Erregerschwer oder Zeitverzögerung nachweis (DNA) im nicht kultivierbar nachweisbar oder in Zusammenhang mit geringer Konzen- Erkrankung? tration vorhanden

6 Molekularbiologische Genotypisierung von Tierpathogenen - Identifizierung - Differenzierung/Typisierung Basis: DNA/RNA (auch auf Grund der Stabilität der Nukleinsäuren) Methoden: - Hybridisierung - Polymerase-Kettenreaktion (PCR) - DNA-Sequenzierung - Micro-Array-Anwendung - PFGE, AFLP DNA-Doppelstrang

7 DNA-Hybridisierung Doppelstrang Denaturierung (hohe T, basisches Milieu) Einzelstrang Renaturierung (opt. T) Typ: Dot-Blot-Hybr. geblottet werden: genom. DNA Southern-Blot-Hybr. PCR-Produkte Northern-Blot-Hybr. Oligonukleotide in-situ-hybr.

8 Sonden: - Oligonukleotide - PCR-Produkte - genom. DNA Markierung: - radioaktive Isotope - Biotin - Digoxigenin - Fluoreszensfarbstoffe (End-/Gesamt-DNA-Markierung) Visualisierung: - Autoradiographie - Schwärzung - Fluoreszensstrahlung - Farbreaktion

9 Anwendung: Nachweis von Mycoplasma bovis mit Gensonden (1990) Screening nach geeignetem Plasmid Vorteil: hohe Spezifität Nachteil: geringe Sensitivität mit Nativmaterial (z. B. Milch) Dot-Blot-Hybridisierung genom. DNA mit pmb9 Weitere Anwendungen: Problem ist die Probenvorbereitung - Ribotyping - RFLP-Analyse bei MT-Komplex - Spoligotyping bei MT-Komplex

10 Tuberkulose bei Zootieren Figure 1 Zoo A Zoo B Figure 2 Camel II (2003) Camel I (2002) Sea lion (2001) transfer Tapir I Tapir I (2005) (2005) Tapir II (2005) Tapir III (2005) Tapir IV (2006) Spacers 1 43 Origin of strains M. tuberculosis H37Rv Negative control M. bovis Sea lion I Camel I Tapir I M. pinnipedii Tapir II (aus Lunge) Tapir III Tapir IV (Moser et al., Vet. Microbiol. 127, , 2008)

11 Die Zeit der PCR beginnt! PCR - exponentielle Vervielfältigung von Target-DNA - Kombination von Hybridisierung und enzymatischer Synthese - Fortführung der Arbeiten zum Nachweis von M. bovis Agarose-Gelelektrophorese der PCR-Produkte Verbesserung der Sensitivität des Nachweises durch eine Fangreaktion mit monoklonalen Antikörpern gegen M. bovis als Anreicherungsschritt Southern-Blot-Hybridisierung mit DIG-markiertem Amplikon (Hotzel et. al., Mol. Cell. Probes , 1999)

12 PCR zum Nachweis Identifizierung spezifischer Zielgene PCR zur Herstellung von Hybridisierungssonden End-/Gesamt- Markierung mit Biotin/Digoxigenin Multiplex-PCR PCR-Fingerprinting RT-PCR Nachweis von RNA-Viren real-time-(rt)-pcr qualitativer und quantitativer Nachweis

13 PCR zur Identifizierung der beiden Subspezies von Campylobacter fetus PCR 1 C. fetus subsp. venerealis NCTC C. fetus subsp. fetus DSMZ Negativkontrolle 4 C. fetus subsp. venerealis BS 100/05 5 C. fetus subsp. fetus BS 101/05 6 C. hyointestinalis BS 102/05 7 Größenmarker Duplex-PCR (F. Schulze et al., JCM 44, , 2006)

14 PCR-Fingerprinting von Mycoplasma bovis-isolaten einer Herde mit HUM 1 real-time-pcr zum Nachweis von Campylobacter fetus subsp. venerealis mit SYBR Green TM 03/04 325/99

15 DNA-Sequenzierung DNA-Sequenzierung ist eine Methode zur Ermittlung der exakten Basenabfolge einer zu analysierenden DNA bzw. eines DNA- Bruchstückes. Angewandte DNA-Sequenzierungsmethoden a) MAXIM-GILBERT-Methode (basenspezifische Spaltung der DNA) b) SANGER-Methode (Kettenabbruch-Verfahren) c) Cycle sequencing -Methode (Kettenabbruch-Verfahren) zu c) - radioaktiv- oder Fluoreszenzfarbstoff-markierte Sequenzierungsprimer in Verbindung mit Abbruch-(Terminator)-Reagenzien (ddntps) werden in einer linearen Amplifikationsreaktion verwendet - Sequenzierungsprimer und Fluoreszenzfarbstoff-markierte Terminatoren (z. B. BIG DYE -modifizierte ddntps) werden in einer linearen Amplifikationsreaktion eingesetzt

16 Analyse der Sequenzierungsprodukte - Elektrophorese auf Polyacrylamid-(PAA)-Gel mit anschließender Autoradiographie bei radioaktiver Markierung -Elektrophorese auf PAA-Gel und Analyse der Laser-induzierten Fluoreszenz durch spezielle Detektoren -Kapillar-Elektrophorese und Analyse der Laser-induzierten Fluoreszenz durch spezielle Detektoren

17 Anwendungen: - 16S-rRNA-Gene: Speziesbestimmung - spezies-spezifische Markergene: Speziesbestimmung - Multi-Locus-Sequence-Typing: Vergleich von Isolaten inner- ( house-keeping -Gene) halb einer Spezies - VNTR-Typing: Vergleich von Isolaten inner- (variable number of tandem halb einer Spezies repeats) - Gesamtgenomsequenzierung: höchster Informationsgehalt, aber kostenintensiv

18 VNTR-Typing deutscher Francisella-tularensis-Isolate H. Tomaso, NRL für Tularämie

19 , 6, 11 - Größenmarker 2 - BS57/03 (B/W) 3 - BS210/02 (B/W) 4 - BS212/02 (B/W) 5 - BS99/03 (B/W) 7 - BS101/03 (B/W) 8 - BS105/03 (B/W) 9 - BS76/04 (B) 10 - BS75/04 (T) Makrorestriktionsanalyse (SmaI) von C. fetus subsp. venerealis- Isolaten mittels Pulsfeld-Gelelektrophorese

20 Mikro-Array-Anwendung zum Nachweis und Differenzierung von Chlamydiales - Chlamydien: obligat intrazelluläre Bakterien mit einzigartigem Lebenszyklus (extrazelluläre Elementarkörper/intrazelluläre Retikularkörper) Wichtiger Vertreter: Chlamydophila psittaci (zoonotisches Potential) - Verordnung zum Schutz gegen die Psittakose und Ornithose (Psittakose-Verordnung) vom Symptome bei Vögeln: Lethargie, Hyperthermie, Augenausfluss, verminderte Legeleistung, Diarrhoe, Pneumoenteritis - Symptome beim Menschen: grippeähnliche fiebrige Allgemeininfektion, aber auch Pneumonien, Endokarditiden, Enzephalitiden,Todesfälle - Diagnostik: - Kultivierung in Zellkultur oder über Hühnereier - Färbeverfahren - Antikörper-ELISA - PCR (inkl. RFLP und DNA-Sequenzierung) - real-time -PCR - Microarrays

21 Primer 16SF2 0 Primer U23F bp Primer 23R bp 400 bp 600 bp 800 bp Signatursequenz, Domäne 1 (627 bp) Primer 23SIGR 1kb 16S-rRNA-Gen ( 1550 bp) intergenic spacer 23S-rRNA-Gen ( 2940 bp) Beispiel: Cp. psittaci (K. Sachse et al., Mol. Cell. Probes 19, 41-50, 2005)

22 Gegenwärtig verfügbare Microarrays zur Chlamydien-Identifizierung und Differenzierung: - Chip zur Chlamydiales-Identifizierung(23S rrna-gen): eine PCR nötig - Chip zur Genotypisierung von Chlamydophila psittaci (ompa-gen): zwei PCRs - Chip zur Genotypisierung von Chlamydia trachomatis (ompa-gen): drei PCRs Vorteile der Diagnostik mit vorgestellten DNA-Microarrays - Sehr schnelle Methode - Analyse kann aus verschiedenen Matrices erfolgen - Keimzahl kann sehr gering sein - Sensitivität vergleichbar mit real-time -PCR - ermöglicht Identifizierung der bekannten Chlamydien-Spezies - es können aber auch neue Arten identifiziert werden (über Genus-Sonden)

23 Weitere Chips sind in der Anwendung, z. B. zur Identifizierung undtypisierung von Staphylococcus-aureus-Isolaten (darunter MRSA) - liefert einen genetischen Fingerabdruck jeden Isolates Sonden - geht von genomischer DNA aus - Gesamtgenom wird mit Biotin markiert - auch Protein-Chips sind möglich

24 Fazit: - Es existiert eine Vielzahl von anwendungsbereiten Methoden zur molekularbiologischen Identifizierung und Charakterisierung von Bakterien, die im Zusammenhang mit Erkrankungen bei Tieren stehen. - Das Spektrum der bevorzugt angewandten Methoden hat sich in den letzten zwanzig Jahren verändert. - Es gibt modische Methoden, die aber durchaus ihre Berechtigung haben. - Das Prinzip der PCR hat die Diagnostik von bakteriell bedingten Tiererkrankungen revolutioniert. - Die DNA-Sequenzierung liefert den höchsten Informationsgehalt. - Wichtig ist immer, zuerst das Ziel der Untersuchungen im Auge zu haben und danach die anzuwendenden Methoden auszuwählen.

25 Ein herzlicher Dank geht an alle Mitarbeiter und Kooperationspartner, mit denen ich im Laufe der Zeit zusammenarbeiten durfte!