CML Chromosomenanalyse und FISH Claudia Haferlach MLL Münchner Leukämie Labor

Transkript

1 CML Chromosomenanalyse und FISH Claudia Haferlach MLL Münchner Leukämie Labor

2 Befundbericht bei Diagnose

3 Karyotyp: 46,XY,t(9;22)(q34;q11) 9q+ 22q-

4 Nomenklatur Telomer Region kurzer Arm "p" Zentromer Region 1 Bande Region langer Arm "q" 1 Telomer Region

5 Nomenklatur 46,XX,t(9;22)(q34;q11) [4] 47,XX,+8,t(9;22)(q34;q11) [5] 47,XX,+8,t(9;22)(q34;q11),i(17)(q10) [11] 46,XX [5]

6 Befundbericht im Verlauf

7 Befundbericht Molekulargenetik

8 Remissionskriterien Zytogenetische Remission bei der CML Definition der Remission Komplett Major Minor Minimal 66-95% Kein Ansprechen Ph+ Metaphasen 0% 1-35% 36-65% 96% Molekulargenetische Remission bei der CML entspricht von 25 MP 0 bis entspricht Ratio von Definition der Remission Komplett Major Minor Kein Ansprechen BCR-ABL Ratio 0 0,1 0,

9 CML 1960: Erstbeschreibung des Philadelphia- Chromosoms durch Nowell und Hungerford 1973: Identifizierung dert(9;22)(q34;q11) durch Janet Rowley 1983: BCR-ABL-Fusionsgen als molekukares Korrelat der t(9;22) identifiziert 1990: erhöhte Tyrosinkinase Aktivität des BCR- ABL-Proteins als Ursache der malignen Transformation 1995: Entwicklung eines Tyrosinkinase- Inhibitors 2000: Zulassung von Imatinib

10 RT-PCR FISH, PCR, Southern-Blot Chromosom Chromosomenanalyse mrna RNA Zellkern Protein Western-Blot

11 Zytogenetik: Methoden der CML Diagnostik Goldstandard in Bezug auf Therapie-Ansprechen, Nachweis von zusätzlichen Aberrationen, Nachweis Ph-negativer Klone Fluoreszenz in situ Hybridisierung auch an Zellkernen möglich Hypermetaphasen-FISH sensitiver als Zytogenetik, auch anwendbar bei Ph-, BCR-ABL+ CML RT-PCR: qualitativ + quantitativ sensitivste Methode zum Nachweis minimaler Resterkrankung Sequenzierung Nachweis von BCR-ABL-Resistenzmutationen

12 Philadelphia-Translokation - BCR-ABL-Rearrangement BCR BCR/ABL ABL ABL/BCR 9 22 der(9) der(22)

13 BCR-ABL-Fusionsprotein BCR/ABL Fusion gene Fusions mrna Fusions Protein

14 Tyrosinkinase-Inhibitor

15 Zytogenetik Chromosomenanalyse

16 Bedeutung der Zytogenetik Überblick über alle mikroskopisch sichtbaren Chromosomenaberrationen, kein Vorwissen erforderlich Nachteile: lebende Zellen mit ausreichender Proliferationsaktivität in vitro erforderlich niedrige Auflösung, molekulare Mutationen nicht sichtbar mind. 48h bis Ergebnis

17 Bedeutung der Chromosomenanalyse Nachweis der Standard-Philadelphia- Translokation bzw. einer varianten Philadelphia-Translokation Nachweis von zusätzlichen Chromosomenaberrationen / Krankheitsprogression zytogenetisches Ansprechen auf die Therapie stellt einen entscheidenden prognostischen Parameter dar kein Nachweis einer Ph-Translokation bei Phnegativer/BCR-ABL-positiver CML

18 Methode Chromosomeanalyse Ansatz von Kulturen Kultivierung über 24 bzw. 48h Zugabe des Spindelgiftes Colcemid weitere Inkubation von 2 bzw. 24h Zentrifugation - Inkubation 20 min hypotone KCl-Lösung Zentrifugation - Fixation in Carnoy s Fixativ Auftropfen auf Objektträger Bänderung - Färbung (Q-Banden, G-Banden etc.) Metaphasen-Suche Auswertung

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25 Karyotyp: 46,XY,t(9;22)(q34;q11) 9q+ 22q-

26 Karyotype: 47,XY,+8,t(9;22)(q34;q11)

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28 Zusatzaberrationen im Ph+ Klon Übergang von chronischer Phase in die Blastenkrise geht meist mit dem Auftreten von Zusatzaberrationen einher 80% der Patienten in BK weisen Zusatzaberrationen auf Zusatzaberrationen sind mit einer niedrigen Ansprechrate auf Tyrosinkinase-Inhibitoren assoziiert

29 Progressions-freies Überleben bei Patienten mit CML mit und ohne klonale Evolution unter Imatinib-Therapie Marktel et al. Haematologica 2003

30 Zusatzaberrationen im Ph+ Klon major route Aberrationen +8 +der(22)t(9;22) +19 i(17)(q10) minor route Aberrationen Zugewinne der Chromosomen 17 und 21 Verluste der Chromosomen Y, 7, 17 t(3;21)(q26;q22)

31 46,XY,t(9;22)(q34;q11),i(17)(q10)

32 47,XY,+8,t(9;22)(q34;q11)

33 Auftreten von Philadelphia-negativen Klonen Auftreten von Klonen mit zytogenetischen Aberrationen ohne Philadelphia- Translokation Häufigkeit: 5-10% alles Fälle in zytogenetischer Remission Häufigste Aberration: Trisomie 8 Klinische Relevanz bisher weiterhin unklar

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35 Fluktuation des Ph negativen Klons U. Bacher et al., Leukemia 2005

36 Fluoreszenz in situ Hybridisierung FISH

37 Bedeutung von FISH in der CML-Diagnostik Vorwissen über die vermutete Aberration notwendig, Auswahl der Sonden entscheidet, welche Aberration nachgewiesen werden kann Zellen in Teilung nicht in jedem Fall erforderlich schnell, Ergebnis innerhalb von Stunden möglich BCR-ABL-Rearrangement auch bei Phnegativer/BCR-ABL-positiver CML möglich Hypermetaphasen-FISH als Äquivalent zur zytogenetischen Remission bei Ph-negativer, BCR-ABL-positiver CML (Nachweis von Resterkrankung)

38 Fluorescence in situ hybridisation Patient DNA on slide Denaturation of DAN double strands to single strands Fluorescence dye Hybridisation of patient DNA and probe specific probe

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40 Philadelphia translocation - BCR-ABL-rearrangement Translokation Chromosome 9Chromosome 22 9q+ 22qnuc ish 9q34(ABLx3),22q11(BCRx3)(ABLconBCRx2)

41 FISH- Assay zum Nachweis eines BCR-ABL-Rearrangements Translokation Chromosom 9 Chromosom 22 9q+ 22qnuc ish 9q34(ABLx3),22q11(BCRx3)(ABLconBCRx2)

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43 t(9;22)(q34;q11) mit Deletion des 5 ABL- Anteils Chromosom 9 Chromosom 22 9q+ 22qnuc ish 9q34(ABLx2),22q11(BCRx3)(ABLconBCRx1)

44 t(9;22)(q34;q11) mit Deletion des 3 BCR-Anteils Chromosom 9 Chromosom 22 9q+ 22q- nuc ish 9q34(ABLx3),22q11(BCRx2)(ABLconBCRx1)

45 t(9;22)(q34;q11) mit Deletion des 5 ABL- und des 3 BCR-Anteils Translokation Chromosom 9 Chromosom 22 9q+ 22qnuc ish 9q34(ABLx2),22q11(BCRx2)(ABLconBCRx1)

46 Submikroskopische Deletionen der 5 Region des ABL-Gens und der 3 Region des BCR-Gens Therapie: Interferon 250 Patienten, 9% Deletionen 251 Patienten, 15% Deletionen Kolomietz et al. Blood 2001 Huntly et al. Blood 2001

47 der(9) Deletionen unter Imatinib-Therapie kein prognostich negativer Faktor bzgl. Gesamtüberleben, jedoch bzgl. progressionsfreiem Überleben kein prognostich negativer Faktor bzgl. Gesamtüberleben, und bzgl. rezidivfreiem Überleben Huntly et al., Blood 2003 Quintas-Cardama et al., Blood 2005

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59 Zusammenfassung Chromosomenanalyse Goldstandard für Evaluation des Therapieansprechens Informationen über klonale Evolution im Ph+ Klon Detektion von Ph- Klonen FISH schneller Nachweis des BCR-ABL-Rearrangements auch bei Ph-, BCR-ABL+ CML einsetzbar Nachweis von Deletionen in der Bruchpunktregion Quantitative RT-PCR sensitivste Methode zum Nachweis von Resterkrankung Mutationsanalyse Nachweis von Mutationen in der BCR-ABL-Kinase- Domäne als Resistenz-Mechanismus