Spektrale Farbtrennung in der konfokalen Laser Scanning Mikroskopie

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1 1. Jenaer Workshop Spektralsensorik Spektrale Farbtrennung in der konfokalen Laser Scanning Mikroskopie Dr. Monika Marx Training, Application and Support Center TASC, Carl Zeiss MicroImaging GmbH Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 1 Was ist Konfokale Mikroskopie? Konfokale Laser Scanning Mikroskope: Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 2 1

2 Die Fokusebene Hinter der Fokusebene (unscharf) Im Fokus ( scharf zu sehen) Vor der Fokusebene (unscharf) Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 3 Was ist Konfokale Mikroskopie? -Das Prinzip: Problem bei dickeren Präparaten (> 20µm): In der klassischen Weitfeldmikroskopie überlappen Fluoreszenz-Signale aus der Fokusebene mit Signalen aus Ebenen darunter und darüber: Anregung Emission ZEISS Plan-NEOFLUAR 40x /1,3 Oil ZEISS Plan-NEOFLUAR 40x /1,3 Oil 3-fach Fluoreszenzfärbung, Weitfeld Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 4 2

3 Was ist Konfokale Mikroskopie? -Das Prinzip: Ziel: Nur das Signal aus der Fokusebene soll detektiert werden. Anregung Emission ZEISS Plan-NEOFLUAR 40x /1,3 Oil ZEISS Plan-NEOFLUAR 40x /1,3 Oil 3-fach Fluoreszenzfärbung, Konfokal Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 5 Was ist Konfokale Mikroskopie? -Das Prinzip: Laser Präparat Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 6 3

4 Was ist Konfokale Mikroskopie? -Das Prinzip: In die konfokale Ebene wird eine Blende (Pinhole) eingebracht, die Licht ausserhalb der Fokusebene aussperrt PMT Pinhole Laser Präparat Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 7 Was ist Konfokale Mikroskopie? -Das Prinzip: In die konfokale Ebene wird eine Blende (Pinhole) eingebracht, die Licht ausserhalb der Fokusebene aussperrt PMT Pinhole Laser Der Durchmesser des Pinholes bestimmt die dicke des optischen Schnitts: Präparat Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 8 4

5 Vom Punkt zum Bild: Punktscanner LSM 510 Abrastern des Präparates in XY Richtung Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 9 Vom flachen Bild zur 3D Information Optischer Schnitt in verschiedenen Ebenen des Präparates X/Y/Z Stack Z-Fokussiertrieb Die 3-dimensionale Information entsteht durch meherere aufeinanderfolgende Aufnahmen in verschiedenen Tiefen des Präparates Das Ergebnis ist ein 3D Bilderstapel, bestehend aus verschiedenen optischen Schnitten Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 10 5

6 Von 3D zu 4D: Langzeitbeobachtungen in XYZ+Zeit Beobachtete Zeit 20 min. 4 Sek. pro Bildstapel 100 Bilderstapel Film Wiedergabe: 17 Bilder/Sek Präparat: Drosophila Embryo in Gastrulationsphase Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 11 Von 3D zu 4D: Langzeitbeobachtungen in XYZ+Zeit Beobachtete Zeit 20 min. 4 Sek. pro Bildstapel 100 Bilderstapel Film Wiedergabe: 17 Bilder/Sek Präparat: Drosophila Embryo in Gastrulationsphase Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 12 6

7 Mehrfarbige konfokale Aufnahmen Einfarbige Aufnahmen PMT LP 505 Laser Präparat Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 13 Mehrfarbige konfokale Aufnahmen Zweifarbige Aufnahmen PMT LP 560 BP Neben- Farbteiler PMT Laser Präparat Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 14 7

8 Multifluoreszenz Aufnahmen Die Anfärbung von mehreren Moleküle gleichzeitig eignet sich optimal, um deren Wechselwirkungen miteinander in der natürlichen Umgebung zu studieren. Der parallele Gebrauch unterschiedlicher Fluoreszenzfärbungen Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 15 Das Problem dabei: Farbdurchschlag FITC / Rhod Simultane Aufnahme Simultane Aufnahme FITC Rhod beide Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 16 8

9 Vermeidung des Farbdurchschlags ( crosstalk ) durch sequentielle Bildaufnahme Sequentiell Sequentiell FITC Rhod beide Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 17 Spektral naheliegende Farben lassen sich nicht mehr durch Farbfilter trennen Vor allem verschiedene Varianten der fluoreszierenden Proteine, wie z.b. BFP (blau), CFP (cyan) GFP (grün) oder YFP (gelb) werden sowohl mit ähnlichen Wellenlängen angeregt und emittieren hoch überlappend. Anregung Emission (spectra published by Clonetech) Anregungs-crosstalk Emissions-crosstalk Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 18 9

10 LSM 510 META Die Lösung LSM 510 META 1) Parallele spektrale Bildaufnahme 2) Mit Hilfe der Spektren können die einzelnen Signale getrennt werden META Detektor Emission Fingerprinting Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 19 LSM 510 META Innovative detector concept LSM 510 META META Detektor PMT Liniemit 32 Elementen zur Aufnahme des vollen Spektrums Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 20 10

11 Spektrale Detektion mit dem LSM 510 META Jeder einzelne Detektor repräsentiert eine spektrale Bandbreite von 10nm. Es erfolgt eine parallele Detektion der spektralen Information des Emissions- Signals Die spektralen Daten werden als so genannte Lambda Stapel gespeichert (X,Y, Lambda). 550nm 539nm 528nm 518nm 507nm 496nm Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 21 Emission Fingerprinting Das Prinzip 1 Aufnahme von Lambda Stapel(n) Aufnahme des kompletten Spektrums (Lambda Stapel: x([yzt]-λ) 2 Auswahl von Referenz-Spektren Entweder direkt aus dem Lambda Stapel oder aus bereits gespeicherten Spektren 3 Linear Unmixing Trennung der Emissions-Signale Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 22 11

12 Emission Fingerprinting 1. Bildaufnahme: Alles grün: FITC-phalloidin und Sytox-green (Anregung mit 488 nm) Zellkultur gefärbt mit FITC-Phalloidin und Sytox-green Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 23 Emission Fingerprinting 2. Lambda Stapel 1. Lambda Stapel 2. Referenz Spektren Sytox-green FITC Zellkultur gefärbt mit FITC-Phalloidin und Sytox-green Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 24 12

13 Emission Fingerprinting 3. Trennung der Farben Trennung von FITC-Phalloidin und Sytox-green 3. Linear Unmixing Zellkultur gefärbt mit FITC-Phalloidin und Sytox-green Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 25 Emission Fingerprinting Wie funktioniert s? GFP YFP Referenzspektren der zu entmischenden Farben Gemessenes Misch-Spektrum Relative Anteile (Bsp.) 0,68 0,32 Lineares Entmischen (unmixing) ergibt die präzisen Verhältnisse beider Komponenten Jeder einzelne Pixel wird so entmischt! Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 26 13

14 Emission Fingerprinting 4 fluoreszierende Proteine CFP, CGFP, GFP und YFP Die klassische, filterbasierte Aufnahme ergäbe ein rein grünes Bild Sample: Drs. Miyawaki, Hirano, RIKEN, Wako, Japan Cultured cells expressing 4 FPs in ER, nuclei, plasma membranes and mitochondria, respectively. Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 27 Emission Fingerprinting 4 fluoreszierende Proteine CFP, CGFP, GFP und YFP als Lambda-Stapel Intensity Emission wavelength (nm) ROI 1 ROI 2 ROI 3 ROI 4 Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 28 14

15 Emission Fingerprinting 4 fluoreszierende Proteine CFP, CGFP, GFP und YFP Sample: Drs. Miyawaki, Hirano, RIKEN, Wako, Japan Cultured cells expressing 4 FPs in ER, nuclei, plasma membranes and mitochondria, respectively. 4 getrennte Kanäle nach Entmischung Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 29 Der derzeitige Weltrekord im Unmixing liegt bei 6 Fluoreszierenden Proteinen in einer Zelle! Takako Kogure, Satoshi Karasawa, Toshio Araki, Kenta Saito, Masataka Kinjo4 & Atsushi Miyawaki Nature Biotechnology 24, (2006) Atsushi Miyawaki Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 30 15

16 Der derzeitige Weltrekord im Unmixing liegt bei 6 Fluoreszierenden Proteinen in einer Zelle! Anregung: 458nm. Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 31 Anwendungen: Umgang mit Autofluoreszenz Alexa Fluor 532, Cy3, und Autofluoreszenz Section through fly (Drosophila melanogaster) retina labeled with Alexa Fluor 532 (-phalloidin) and Cy3 (Na + /K + -ATPase immunostain) Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 32 16

17 Anwendungen: Umgang mit Autofluoreszenz Alexa 532 Cy3 Autofluoreszenz 1-fach gefärbte Kontrollen (Alexa 532, Cy3) Ungefärbte Kontrolle (Autofluoreszenz) O. Baumann, Univ. Potsdam, Germany Alexa Cy3 Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 33 Anwendungen: Lebendzell-Beobachtungen in 5 Dimensionen (XYZ, t, l ) Beobachtete Zeit 16 Stunden Film Präparat: Zellkultur, CFP/GFP/YFP Fusionsprotein mit Histon 2B Von: Prof. Saiwaki, Japan Carl Zeiss MicroImaging - Dr. Monika Marx Seite 34 17

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