SPRINGER LABOR MANUAL

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1 SPRINGER LABOR MANUAL

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3 Martin Holtzhauer Biochemische Labormethoden Zweite, iiberarbeitete Auflage Mit 15 Abbildungen, Springer

4 Dr.rer.nat.habil. Martin Holtzhauer Institut rur Biochemie und Molekulare Physiologie Universitat Potsdam c/o Max-Delbriick-Centrum rur Molekulare Medizin Robert-Rossle-Str. 10, D Berlin-Buch ISBN-13: e-isbn-13: DOl: / Die Deutschen Bibliothek CIP-Eintrag beantragt Dieses Werk ist urheberrechtlich geschutzt. Die dadurch begrundeten Rechte, insbesondere die der Ubersetzung, des Nachdrucks, des Vortrags, der Entnahme von Abbildungen und Tabellen, der Funksendung, der Mikroverfilmung oder der VervielfaItigung auf anderen Wegen und der Speicherung in Datenverarbeitungsanlagen, bleiben, auch bei nur auszugsweiser Verwertung, vorbehalten. Eine VervieWiltigung dieses Werkes oder von Teilen dieses Werkes ist auch im Einzelfall nur in den Grenzen der gesetzlichen Bestimmungen des Urheberrechtsgesetzes der Bundesrepublik Deutschland yom 9. September 1965 in der jeweils geltenden Fassung zulassig. Sie ist grundsatzlich vergutungspflichtig. Zuwiderhandlungen unterliegen den Strafbestimmungen des Urheberrechtsgesetzes. Springer-Verlag Berlin, Heidelberg 1995 Die Wiedergabe von Gebrauchsnamen, Handelsnamen, Warenbezeichnungen usw. in diesem Werk berechtigt auch ohne besondere Kennzeichnung nicht zu der Annahme, dab solche Namen im Sinne der Warenzeichen- und Markenschutz-Gesetzgebung als frei zu betrachten waren und daher von jedermann benutzt werden durften. Sollte in diesem Werk direkt oder indirekt auf Gesetze, Vorschriften oder Richtlinien (z.b. DIN, VDI, VDE) Bezug genommen oder aus ihnen zitiert worden sein, so kann der Verlag keine Gewahr fur Richtigkeit, Vollstandigkeit oder Aktualitat Ubernehmen. Es empfielt sich, gegebenenfails fur die eigenen Arbeiten die vollstandigen Vorschriften oder Richtlinien in der jeweils gultigen Fassung hinzuzuziehen. Die Vorschriften fur die praktische AusfUhrung von biochemischen Methoden, die in vorliegendem Buch gegeben werden, entbinden den Leser nicht von seiner Verantwortlichkeit, die notigen Sicherheitsvorkehrungen zu treffen. Weder der Autor noch der Verlag Ubernehmen irgendeine Haftung. Einbandgestaltung: Struve & Partner, Heidelberg Satz: Datenkonvertierung durch Lewis & Leins Buchproduktion, Berlin; Herstellung: PRODUserv Springer Produktions-Gesellschaft, Berlin SPIN: / Gedruckt auf saurefreiem Papier.

5 Vorwort Biochemische Methoden flieben in immer zahlreichere benachbarte Wissensbereiche ein. Fur die Losung der jeweiligen Aufgaben werden altbewahrte ebenso wie erst vor wenigen Jahren publizierte Laborverfahren benotigt, von denen einige tagtaglich angewandt werden, andere aber so selten, dab ihre Details aus der Erinnerung verschwunden sind. Meist besitzt der in den biowissenschaftlichen Disziplinen Arbeitende eine Vielzahl von ausgefeilten Spezialvorschriften fur die Losung der unmittelbaren Arbeitsaufgaben, fur nicht taglich benotigte Methoden ist man jedoch auf die Suche in der Fachliteratur angewiesen, und nicht immer labt sich die in einer Originalarbeit beschriebene Methode ohne Schwierigkeiten nacharbeiten. Aus dieser Erfahrung heraus resultiert das Bemuhen, eine begrenzte Auswahl von Laborvorschriften und Tabellen zusammenzustellen, die auf ihre Praktikabilitat hin uberpruft wurden und die hiermit Fachkolleginnen und -kollegen in der Form von Protokollen vorgelegt werden in der Hoffnung, dab ihre Beschreibung so erfolgte, dab bei einiger Laborpraxis ein muheloses und erfolgreiches Nacharbeiten moglich ist. Die Auswahl wurde unter dem Gesichtspunkt getroffen, moglichst vielseitig verwendbare Labormethoden aufzunehmen, aber selbstverstandlich waltet in jeder Auswahl eine gewisse Willkur. Ebenso konnen die "Biochemischen Labormethoden" nicht die Originalliteratur ersetzen, die deshalb in der Regel bei den Vorschriften oder Kapiteleinleitungen als Quelle angegeben wurde. 1m Hinblick auf ein handliches Format dieser Arbeitsblatter wurde darauf verzichtet, Analysenverfahren fur spezielle Substanzen und Enzyme aufzunehmen, da Auswahl und Beschrankung auf diesem Gebiet kaum moglich erscheint. Es wurde auch bewubt auf Erlauterungen zur Theorie der vorgestellten Methoden verzichtet. Entsprechende einfuhrende Literatur ist sicherlich in der unmittelbaren Umgebung der Nutzer der "Biochemischen Labormethoden" zu finden. Urn den Rahmen eines handhabbaren Laborbuchs fur biochemische Methoden nicht zu sprengen, wurde auberdem auf Methoden verzichtet, die unmittelbar im Zusammenhang mit der Gentechnik stehen, d.h. auf DNA- und RNA-Isolations-, Charakterisierungs-, Sequenzierungs- und Manipulationsmethoden, zumal anzunehmen ist, dab in den entsprechenden Labors die einschlagigen exquisiten Standardwerke wie der "MANIATIS" vorhanden sind. Der Zweck dieser Zusammenstellung ware erfullt, wenn sie als praktisches Hilfsmittel im Labor die tagliche Routine erleichterte oder zur eigenen Sammlung von bewahrten Vorschriften anregen wiirde. Vor allem soli aber erreicht werden, die Scheu vor einer Erweiterung des individuellen Methodenspektrums abzubauen und die Arbeitsmethoden, sowohl die der Originalliteratur, die hier vorgelegten als auch die eigenen, kritisch zu uberprufen und zu erweitern.

6 VI Vorwort DaB trotz der unermeblichen Fiille von Originalarbeiten und zahlreichen hervorragenden Methodenzusammenstellungen dennoch ein Bedarfbesteht, zeigt der Umstand, dab fur das vorliegende Bandchen eine zweite, iiberarbeitete Auflage vorgesehen wurde. SchlieBlich sei allen Kollegen, die durch eine angeregte Diskussion die Zusammenstellung dieser Methodensammlung forderten, einer ersten kritischen Uberpriifung unterzogen und bei der Ausmerzung nicht weniger Fehler behilflich waren, sowie Frau Dr.HERTEL und Frau Dr.BoRscH-SUPAN yom Springer-Verlag, mit deren Hilfe es moglich war, manche "Betriebsblindheit" zu vermeiden, herzlich gedankt. Martin Holtzhauer Berlin-Buch, im Oktober 1994

7 Inhaltsverzeichnis Abkiirzungen.... XIII 1 Quantitative Methoden Quantitative Proteinbestimmungen Proteinbestimmung nach LOWRY u. Mitarbeitern Standardmethode Mikromethode Proteinbestimmung nach LOWRY u. Mitarbeitern in Gegenwart storender Begleitsubstanzen Proteinbestimmung nach BRADFORD Proteinbestimmung in Probenlosungen fur die SDS-Ge1elektrophorese Proteinbestimmung mit Amidoschwarz Mikro-Biuret-Methode Proteinbestimmung mit BCA (Bicinchoninsiiure) Standardmethode Mikromethode Proteinbestimmung nach KJELDAHL Protein-Konzentrationsbestimmung durch UV -Absorptionsmessung (Photometrie) 1.2 Quantitative Nucleinsiiurebestimmungen DNA-, RNA- und Proteintrennungsgang nach SCHMIDT und THANNHAUSER RNA-Bestimmung mit Orcin DNA-Bestimmung mit Diphenylamin DNA- bzw. RNA-Bestimmung in Gewebehomogenaten Quantitative Nucleinsiiurebestimmung durch UV-Messung 1.3 Quantitative Phosphatbestimmung Bestimmung von anorganischem Phosphat Bestimmung von Gesamt-Phosphat Phospholipid-Bestimmung 1.4 Monosaccharid-Bestimmung Auswertung quantitativer Analysen 2 Elektrophorese Elektrophoresesysteme SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach LAEMMLI SDS-Polyacrylamid-Ge1e1ektrophorese nach WEBER, PRINGLE und OSBORN Harnstoff-SDS-Polyacrylamid -Gelelektrophorese zur Trennung nierdermolekularer Proteine

8 VIII Inhaltsverzeichnis TRI CINE-SDS-Polyacrylamid -Gelelektrophorese rur Proteine und Oligopeptide im Molmassenbereich von 1000 bis Dalton.... SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bei ph 2.4 Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bei ph 2 Anodisches diskontinuierliches Polyacrylamid -Gelelektrophoresesystem.... Kathodisches diskontinuierliches Polyacrylamid-Gelelektrophorese-System Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (IEF und SDS-PAGE) Erste Dimension: Isoelektrische Fokussierung (IEF) Zweite Dimension: SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Nicht-denaturierende Nucleinsaure-Elektrophorese Denaturierende Nucleinsaure-Elektrophorese Identifizierung von Phosphoaminosauren (Papierelektrophorese) Hilfsmittel rur die Kontrolle der Elektrophorese Markerfarbstoffe fur die Kontrolle der Elektrophorese Anodische Systeme Kathodische Systeme Eichproteine fur die Polyacrylamid-Gelelektrophorese Kovalente Farbmarkierung von Eichproteinen Farbemethoden Proteinfarbung mit organischen Farbstoffen Amidoschwarz 10 B Coomassie Brillant Blue R250 bzw. G Fast Green Stains All Silberfarbung von Proteinen (Glutaraldehyd-Fixierung) CitratlFormaldehyd-Entwicklung Alkalische Entwicklung Silberfarbung mit W olframatokieselsaure Kontraststeigerung nach BERSON Silberfarbung von Proteinen (Formaldehyd-Fixierung) Silberfarbung von Glycoproteinen und Polysacchariden Abschwachen von silbergefarbten Gelen Farbung von Proteinen auf Blotting-Membranen Farbungen auf Nitrocellulose-Blotting-Membranen mit Farbstoffen Proteinfarbung auf Nitrocellulose-Blotting-Membranen mit Tusche Farbung auf Nitrocellulose mit kolloidalem Gold Proteinfarbung aufpvdf-blotting-membranen mit Farbstoffen Farbung von Proteolipiden bzw. Lipiden und Lipoproteinen Farbung von Glycoproteinen und Polysacchariden Farbung mit SCHIFFschem Reagenz (PAS staining) Farbung mit Thymol Elektroelution aus Gelen Quantitative Elektroelution von Proteinen aus Polyacrylamid-Gelen Entfernung von SDS Elektrotransfer von Proteinen (Western blot)

9 Inhaltsverzeichnis IX Immunchemischer Antigennachweis nach Elektrotransfer Detektion von Meerrettich-Peroxidase (POD) Detektion von alkalischer Phosphatase (AP) Chemoluminiszenz-Detektion auf Blotting-Membranen Kohlenhydrat-spezifische Glycoprotein-Detektion nach Elektrotransfer Allgemeiner Kohlenhydrat-Nachweis auf Western blots Transfer von Nucleinsauren (SOUTHERN- bzw. Northern-Blot) Trocknung von Elektrophoresegelen Autoradiographie von radioaktiv markierten Verbindungen in Elektrophoresegelen Chromatographische Methoden Diinnschichtchromatographie Bestimmung der N-terminalen Aminosaure im Polypeptid (Diinnschichtchromatographie von modifizierten Aminosauren) Trennung von Nucleosidphosphaten Gradienten -Diinnschichtchromatographie Nachweis von Phosphaten Lipidextraktion und Diinnschichtchromatographie von Lipiden 3.2 Saulenchromatographie Praktische Hinweise zur Saulenchromatographie von Proteinen Konzentrierung von ProteinlOsungen Saurefallung Aussalzen Ausfallen mit organischen Verbindungen Lyophilisation Ultrafiltration Gelfiltration Auswahl des Tragermaterials Fiillen einer Gelfiltrationssaule Probenauftrag und Elution Reinigung Bestimmung von AusschluBvolumen Vo und Gesamtvolumen V t Ionenaustauschchromatographie Vorbehandlung von Ionenaustauscher-Materialien Test der Bindungsbedingungen Probenauftrag Elution Reinigung und Regenerierung Hydrophobe Chromatographie Test der Bindungsbedingungen Elution Regenerierung Affinitatschromatographie Bromcyan-Aktivierung von Polysaccharid-Chromatographietragern Kopplung an Bromcyan-aktivierte Gele Bestimmung des gebundenen Diamin-Spacers Herstellung Chlorameisensaureester-aktivierter Perlcellulosen Aktivierung mit CICOONB

10 x Inhaltsverzeichnis Bestimmung des Aktivierungsgrades von ClCOONB-aktivierter Perlcellulose durch HONB-Messung Kopplung von Liganden an ClCOONB-aktivierte Perlcellulose Kopplung von Weizenkeim-Lektin an ClCOONB-aktivierte Perlcellulose Kopplung von Reaktivfarbstoffen an Polysaccharide (Farbstoff-Affinitatschromatographie) Kovalente Bindung von Biotin (Biotin-Avidin/Streptavidin-System) Hochauflosende Ionenaustausch-Chromatographie (HPIEC)' von Mono- und Oligosacchariden Immunchemische Methoden Konjugation von Haptenen (Peptiden) an Carrier-Proteine Aktivierung von Carrier-Protein en Konjugation l.3 Immunisierung Ammonsulfat-Fraktionierung von Immunoglobulinen 4.3 HEIDELBERGER-Kurve Doppelt-radiale Immunodiffusion nach OUCHTERLONY Reinigung des Agars Vorbereitung der Platten Immundiffusion Sichtbarmachung der Prazipitationslinien Immunoprazipitation von Antigenen Immunelektrophorese Gegenstromelektrophorese dot-blot-test Enzym-Immunosorbent-Test (EIA bzw. ELISA) Meerrettichperoxidase-Immunoglobulin-Konjugat (Glutaraldehyd-Methode) Affinitatschromatographische Reinigung von Meerrettichperoxidase Affinitatschromatographie von Immunoglobulin Glutaraldehyd-Konjugation Alkalische Phosphatase-Immunoglobulin-Konjugat (Glutaraldehyd-Methode) Konjugation l.2 Indikatorreaktion fur AP Kopplung (Konjugation) von Glycoproteinen Protein-kolloidales-Gold-Komplex Herstellung des Goldsols Proteinbeladung Zentrifugation Differentialzentrifugation Dichtegradientenzentrifugation Stufengradientenzentrifugation Saccharosegradientenzentrifugation Praparation von Oberflachenmembranen (Sarkolemm, SL) des Herzmuskels Enzym-Bestimmung: Oubain-sensitive Na,K-ATPase

11 Inhaltsverzeichnis XI Rezeptor-Bestimmung: DHP-Bindungsstellen in der Oberflachenmembran Bestimmung der Dissoziations- und Assoziationskinetik des DHP-Rezeptors Nicht-denaturierender Saccharosegradient zur RNA-Trennung Denaturierende RNA-Gradientenzentrifugation Isopyknische Zentrifugation Reinigung hochmolekularer DNA im CsCI-Gradienten Zellfraktionierung mittels Percoll Leukozytenpraparation Drehzahl-Zentrifugalbeschleunigungs-N omogramme 6 Radioaktive Markierung [32p]-Phosphat-Inkorporation in Proteine 6.2 Iodierung mit [125I]-Iodverbindungen Chloramin-T-Methode Iodierung mit BOLTON-HuNTER-Reagens 6.3 Radioaktiver Zerfall Zerfallstabellen fur [32P]Phosphor, [35S]Schwefel und [l25i]iod 6.5 Szintillator-Losungen fur die Flussigszintillationsmessung 7 Puffersysteme pk-werte und Molmassen von Puffersubstanzen 7.2 Diagramm zur Pufferberechnung 7.3 ph-farbindikatoren Puffedosungen Haufig verwendet Puffedosungen Puffer bzw. Medien fur Gewebe- und Zellkulturen bzw. Organperfusion ph-eichpuffer Fluchtige Puffer 8 Reinigungsvorschriften fur ausgewiihlte Laborchemikalien 8.1 Reinigungsmittel Reinigungsvorschriften fur einige Laborchemikalien 9 Tabel1en KonzentrationsmaBe Umrechnung SI-fremder MaBeinheiten in SI-Einheiten 9.3 Molmassen und andere Stoffdaten hilufig verwendeter Substanzen 9.4 Proteindaten Protease-Inhibitoren Aminosaure-Einbuchstabencode und Molmassen der Aminosauren 9.7 Spektroskopische Daten von Nucleotiden Stoffwerte von Detergenzien (Tensiden) Brechungsindex und Dichte von Saccharose-Losungen 9.10 Ammoniumsulfat-Tabelle Angaben zur Herstellung verdunnter Losungen 9.12 Mischungskreuz

12 XII Inhaltsverzeichnis 10 Anhang Statistische Formeln Mittelwert und zusammenhangende GriiEen 10.l.2 Ausgleichsgerade (lineare Regression) t-test Formeln zur Versuchsauswertung Rezeptorbindungsstudien Enzymkinetik Molmassenbestimmung in SDS-Elektropherogrammen 10.3 Software fur die Laborpraxis Datenauswertung und -prasentation Statistik -Programme Sonstiges.... Index

13 Abkurzungen A 280 Ag Ak AP bp BSA %C camp cc cv D DMF DMSO dpm DTE DTT E 280 1% 280 EDTA EGTA EIA g gay gmax I Ig M Mr mak mol-% N NEM PAGE PBS pi Absorption (Extinktion) von Licht der Wellenlange 280 nm Antigen Antikorper alkalische Phosphatase Basenpaare (Nucleinsaure) Rinder-Serumalbumin (engl. bovine serum albumin) prozentualer Antell an Vernetzer (engl. cross-linker), bezogen auf die Gesamtmenge T an Acrylamid-Monomeren cyclo-amp konstanter Strom (engl. constant current) konstante Spannung (engl. constant voltage) Dalton (relative Molmasse) Dimethylformamid Dimethylsulfoxid Zerfalle pro Minute (engl. decays per minute) erythro-l,4-dimercapto-2,3-butandiol (Dithioerythreitol, CLELANDS Reagenz) threo-l,4-dimercapto-2,3-butandiol (Dithiothreitol, CLELANDS Reagenz) Extinktionskoeffizient einer 1 %igen Losung bei der Wellenlange 280 nm molarer Extinktionskoeffizient bei der Wellenlange 280 nm Ethylendiaminotetraessigsaure, Na 2 -Salz Ethylenglycol-bis(N,N,N',N' -aminoethyltetraessigsaure) Enzym-Immunoassay (engl. enzyme-linked immunoassay), auch ELISA relative Zentrifugalbeschleunigung (l.g = 9,81 m s 2) g bei mittlerem Abstand von der Rotorachse g bei maximalem Abstand von der Rotorachse lonenstarke Immunoglobulin (z.b. IgG - Immunoglobulin G) molar (Mole pro Liter) relative Molmasse monoklonaler Antikorper Molekiile pro 100 Molekiile bzw. Mole pro 100 Mole normal (Vale pro Liter) N -Ethylmaleinimid Polyacrylamid -Gelelektrophorese phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlosung (engl. phosphate buffered saline) isoelektrischer Punkt

14 XIV Abkurzungen pk PMSF POD PVDF R f rpm p SDS %T TBS TeA Tris v/v w/v w/w negativer dekadischer Logarithmus der Gleichgewichtskonstanten Phenylmethansulfonsaurefluorid Meerrettich-Peroxidase (engl. horse-radish peroxidase, HRP) Polyvinylidendifluorid (Material fur Ultrafiltrations- und Blotting-Membranen) relative Laufstrecke Umdrehungen pro Minute (engl. revolutions per minute) Dichte Natrium-dodecylsulfat (engl. sodium dodecylsulfate) gewichtsprozentualer Anteil an Gesamt-Acrylamid in einem PAGE-Gel (Acrylamid + Vernetzer) Tris-gepufferte physiologische Kochsalzlosung (engl. Tris buffered saline) Trichloressigsaure Tris-hydroxymethyl-aminomethan Volumen pro (Gesamt-)Volumen Masse pro (Gesamt-)Volumen Masse pro (Gesamt-)Masse