Entwicklung von Methoden zur Immobilisierung an Polymersinterkörpern

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1 Entwicklung von Methoden zur Immobilisierung an Polymersinterkörpern -Immunoassays für die pharmazeutische und lebensmittelchemische Qualitätskontrolle- Dissertation \*' ' ' zur Erlangung des Doktorgrades (Dr. rer. nat.) der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Rheinischen Friedrich-Wilhehns-Universität Bonn vorgelegt von Inke Degener aus Gütersloh Bonn, April 2004

2 Inhaltsverzeichnis INHALTSVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS I V 1 EINLEITUNG Imnuinoassftys....»» »».»»»».»»»...»...»»»».»».»»...»..»..».»»» « Immunoassays mit markiertem Antigen oder Antikörper Assays mit Ligandmarkierung Assaysmit Antikörpennariderung Sandwich Assays Inuntinosensoren.»»»»» »....»...»»»»»»»«....» »»»»» Elektrochemische Immunosensoren Optische Immunosensoren Sonstige Immunosensoren 8 13 Immobilisierung von Biomolekfilen»...»»».....».»»»»,....» ».».»u Adsorptive Immobilisierung Kovalente Immobilisierung Immobilisierung über spezifische Wechselwirkungen Biotin-AvidinoderStreptavidin-System Nickel-Histidin-Wechselwirkung Antikörperimmobilisierung mittels Protein A und Protein G Zucker-Lektin-System Spezielle Analyte der Lebensmittelchemie und Pharmazie Zielsetzung der Arbeit 17 2 MATERIAL UND METHODEN.: Chemikalien, Lösungsmittel, Verbrauchsmaterialien Chemikalien, Antikörper und Polymerkörper Chemikalien Antikörper U Polymere Lösungen und Kulturmedien Lösungen und Puffer zur Oberflächenmodifikation und Immobilisierung Lösungen für ELISA und Polyethylensinterkörper Tests Lösungen für proteinchemisches Arbeiten Medien und Lösungen für Arbeiten mit Mikroorganismen Laboreinrichtung Reinstwasseraufbereiturig Sterilisationsmethoden Reinraumbedingungen/Laminar Airflow Sonstige Geräte und Einrichtungen Oberflfichenmodifikationen....»...».....»..».» »..».»»»» Aktivierung der Polyethylensinterkörper Silanisierung der Polyethylensinterkörper mit 3-Aminopropyltriethoxysilan 35

3 2.3.3 Silanisierung der Polyethylensinterkörper mit 3-Glycidyloxypropyltrimethoxysilan Adsorptive Kopplung von Biomolekülen an PE-Sinterkörper Methoden zur kovalenten Kopplung an aminofunktionalisierte Oberflächen»..»»»»».»...»»».»» NHS-DCC-Methode EDC-Methode Immobilisierung von Streptavidin mittels Glutardialdehyd Immobilisierung von Streptavidin an Epoxygruppen Immobilisierung von Biotin Immobilisierung von BiomolekOlen zur Charakterisierung von Polymeren Immobilisierung von Meerrettichperoxidase (HRP) an Carboxyoberflächen Immobilisierung von HRP an Aminooberflächen Immobilisierung von (His) 6 -DsRed Immobilisierung von (His) 6 -DsRed im Durehfluss Immobilisierung von (His)<rDsRed an Glasoberflachen Synthese von Proteinkonjugaten.»».».»...»»»»...»..»»» Synthese von Protein-Bernsteinsäure-Konjugaten Synthese des Avidin-Bemsteinsäure-Konjugats Konjugation ohne 2-Hydroxyazobenzen-4'-carboxylat (HABA) Zusatz Konjugation mit 2-Hydroxyazobenzen-4'-carboxylat (HABA) Zusatz Synthese des BSA-Bernsteinsäure-Konjugats Synthese von Proteinkonjugaten nach dem gemischten Anhydrid-verfahren Biotinylierung von Antikörpern Biotinylierung des Retrorsins Synthese des Retrorsinhemisuccinates Biotinylierung des Retrorsinhemisuccinates Testsysteme...».».»»»»».»»»...».»« Tetramethylbenzidin (TMB>Durchflusstest zur Charakterisierung der mit HRP immobiliserten Polymere ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) Kompetitiver ELISA Testsysteme zur Charakterisierung der PE-Sinterkörper Charakterisierung von Aminooberflächen Testsysteme auf Basis eines Streptavidin-Farbstofrkonjugates Testsystem zur Untersuchung der mit Listerienantikörper beschichteten PE-Sinterkörper Testsystem zur Untersuchung der mit dem Oleanolsäurekonjugat beschichteten PE-Sinterkörper Testsystem zur Untersuchung der mit dem Retrorsinantikörper beschichteten PE-Sinterkörper Spektralphasen Interferenzspektroskopie Methoden der Proteinchemie Proteinquantifizierung nach Bradford Denaturierende Proteinacrylamid-Gelelektrophorese - SDS-PAGE Proteinreinigung durch Größenausschlusschromatographie Proteinreinigung durch immobilisierte Metallchelat-Affinitäs-chromatographie - IMAC Proteinreinigung durch Ultrafiltration Gewinnung des rekombinant hergestellten Proteins (His) 6 -DsRed : Der Proteingewinnung vorgeschaltete Schritte Proteingewinnung und Proteinreinigung mittels AfHnitätschromatographie Gewinnung des Lysterienlysates»» Kernresonanz-Spektroskopie (NMR)~_»»»»».»»._.»».»..»»».»..».»»»»».».... _ 71

4 ID. 3 ERGEBNISSE Herstellung und Charakterisierung verschiedener Oberflächen auf Polyethylensinterkörpern Funku'onalisierung der Oberfläche mit Sauerstoff Funktionalisierung der Oberfläche mit Aminogruppen Optimierung der APTS-Konzentration Erzeugung einer Avidin-Oberfläche Kopplung des Avidins mit Bernsteinsäureanhydrid Darstellung der Avidin-Oberfläche Herstellung emer Streptavidin-Oberfläche Immobilisierung von Streptavidin mittels löslicher Carbodiimidderivate Immobilisierung von Streptavidin an aminofunktionalisierte PE-Sinterkörper entsprechend der NHS-DCC-Methode Immobilisierung von Streptavidin mittels Glutardialdehyd Immobilisierung von Streptavidin durch Kopplung über Epoxygruppen Erzeugung einer Biotin-Oberfläche Entwicklung verschiedener Modellsysteme zur Charakterisierung von Polymeren Charakterisierung mit Meerrettichperoxidase immobilisierter Faserpolymere Immobilisierung von HRP an aminofunktionalisierte Polymere Immobilisierung der HRP an carboxyfunktionalisierte Polymere Entwicklung von Nickeloberflächen zur Immobilisierung von Poly-Histidin-Fusionsproteinen - untersucht am Bespiel des rot fluoreszierenden Proteins DsRed Gewinnung des rekombinant hergestellten (His) 6 -DsRed Untersuchung der Spezifität der (His) 6 -DsRed-Bindung Einfluss der Aminofunktionalisierung auf die (His) 6 -DsRed-Bindungskapazitat der PE- Sinterkörper Charakterisierung verschiedener APPG derivatisierter Polymere Bestimmung der maximalen Bindungsmenge nach Langmuir Charakterisierung unterschiedlicher Polymere anhand der Reaktionsgeschwindigkeit Immobilisierung des (His) 6 -DsRed im Durchfluss Optimierung der Flussrate Abhängigkeit des (His) 6 -DsRed-Gehaltes auf den PE-Sinterkörpern von der Konzentration der injizierten (His) 6 -DsRed-Lösung Immobilisierung von (His) 6 -DsRed auf planaren Glasträgern Entwicklung von Testsystemen auf PE-Sinterkörpern....».».»»».»»»» Entwicklung eines Testsystems zum Nachweis von Listerien Erzeugung des Antigens Optimierung des Testsystems - Listerien ELISA Optimierung der Konzentration des Fänger- und Detektionsantikörpers Optimierung der Konzentration des HRP-Konjugates Variation der Blockierungsreagenzien Einfluss des Waschpuffers auf das Testergebnis Vergleich verschiedener Fängerantikörper Verwendung eines Listerienantikörper-HRP-Konjugats zur Detektion Untersuchungen zur Reproduzierbarkeit des Listerien ELISA Entwicklung eines Listerientests auf Polymerbasis Immobilisierung des Antikörpers entsprechend der NHS-DCC-Methode Immobilisierung des Antikörpers entsprechend der EDC-Methode Immobilisierung über Metallchelatkomplexe Adsorptive Immobilisierung der Listerienantikörper Entwicklung eines Testsystems zum Nachweis von Oleanolsäure Synthese des Oleanolsäure-BSA-Konjugats Entwicklung eines Oleanolsäure ELSIA Entwicklung eines Nachweissystems zur Erkennung von Oleanolsäure auf Basis der PE- Sinterkörper Entwicklung eines Testsystems zum Nachweis von Retrorsin auf Basis der PE Sinterkörper Synthese des biotürylierten Retrorsins 192

5 IV Inhaltsverzeichnis Entwicklung des Retrorsintestsytems DISKUSSION Herstellung und Charakterisierung verschiedener Oberflächen auf Polyethylensinterkörpern Aktivierung und Silanisierung der PE-Sinterkörper Erzeugung von Avidin- und Streptavidin-Oberflächen auf den PE-Sinterkörpern Erzeugung einer Biotin-Oberfläche Entwicklung verschiedener Modellsysteme zur Charakterisierung der Polymere Charakterisierung mit Meerrettichperoxidase immobilisierter Faserpolymere Entwicklung von Nickel-Oberflächen und Charakterisierung verschiedener PE-Polymerkörper mit dem Poly-Histidin-Fusions-protein (HisVDsRed Entwicklung von Testsystemen auf PE-Sinterkörpern Entwicklung eines Testsystems zum Nachweis von Listerien Entwicklung eines Testsystems zum Nachweis niedermolekularer Analyte ZUSAMMENFASSUNG LITERATUR ANHANG 239