Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde am Fachbereich Biologie der Freien Universität Berlin. vorgelegt von.
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- Sofie Gärtner
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1 S Untersuchungen zur Pharmakokinetik, Pharmakodynamik und Immunogenität des thrombinspezifischen Blutegelwirkstoffes Hirudin bei Tier (Pavian, Schwein) und Mensch Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde am Fachbereich Biologie der Freien Universität Berlin vorgelegt von Johann Bichler aus Tegernsee
2 INHALTSVERZEICHNIS Seite EINLEITUNG 1 MATERIAL UND METHODEN 13 1 Methoden zum Nachweis von Hirudin Thrombin-Henunaktivität im Chromozym TH-Test Radioimmunbioassy (RIBA) Kompetetiver ELISA 18 2 Methoden zur Erfassung von Hirudin-AntikSrpern Indirekter ELISA "Capture-Test"-ELISA Direkter Haut-Test (DHT) Histamin-Release-Test (HRT) Prick-Test 25 3 Jodierung von Hirudin 26 4 Aminosäureanalyse 26 5 Konjugation von Hirudin und Peroxidase 27 6 Hirudin-Präparate und Hirudin-Injektionslosungen 2B 7 Durchführung der Versuche am Menschen Versuchspersonen Versuchsablauf Gewinnung und Lagerung von Probenmaterial 30 8 Experimentelle Durchführung der Versuche am 31 Pavian 8.1 Versuchstiere Versuchsablauf Gewinnung und Lagerung von Probenmaterial 33 9 Experimentelle Durchführung der Versuche am 34 Schwein 9.1 Versuchsgestaltung 35
3 9.2 Probenmaterial Hämatologische Untersuchungen Leukozyten Thrombozyten Hämoglobin Hämatokrit Partielle Thromboplastinzeit Thrombinzeit Quick-Test (PTT) Pharmakokinetische Berechnungen Svmbole. Definitionen und Dimensic makokinetischen Parameter Berechnung der pharmakokinetisehen Parameter 40 für Hirudin aus den Plasma- und Urinkonzentrationen 11.3 Gleichungen für die Berechnung der pharmakoki- 44 netischen Parameter 12 Geräte Substanzen. 46 C ERGEBNISSE UND DISKUSSION 48 I Vorversuche 48 1 Aufbau eines kompetitiven ELISA für Hirudin Einführung Optimierung des Testsystems Vergleich mit dem RIBA Einfluß von Thrombin auf den kompetitiven ELISA 49 2 Entwicklung von ELISA Methoden zum Nachweis von 52 Hirudin-Antikörpern 2.1 Optimierung des indirekten ELISA Nachweis von Affen IgM mit anti-human IgM- 54 Peroxidase
4 2.3 Vergleich der Nachweisgrenzen für Hirudin- 54 Antikörper im indirekten ELISA und im "Capture- Test"-ELISA 3 Gerinnungshemmende Aktivität des Hirudin in 57 vitro 3.1 Einfluß des Hirudins auf globale Gerinnungstests 57 beim Human-Citratplasma 3.2 Einfluß des Hirudins auf globale Gerinnungstests 57 beim Schweine-Citratplasma 4 Hemmung der Hirudinaktivität durch Hirudin- 60 Antikörper in vitro 4.1 Einfluß von Hirudin und Hirudin-Antikörpern auf 60 PTT und Thrombinzeit im Human-Citratplasma 4.2 Einfluß von Hirudin-Antikörpern auf die Hiru- 60 din-hemmaktivität-im Chromozym TH-Test II Pharmakokinetik und Pharmakodynamik des Hirudins 63 (aus Blutegeln) nach intravenöser und subcutarier Injektion beim Menschen 1 Einführung 63 2 Ergebnisse Hirudin-Plasmakonzentrationen 64 - Subcutane Injektion 64 - Intravenöse Injektion Renale Hirudinausscheidung 67 - Subcutane Injektion 67 - Intravenöse Injektion 67 3 Pharmakokinetik Pharmakokinetische Parameter des Hirudins nach 73 intravenöser Injektion
5 - Halbwertszeiten 73 - Geschwindigkeitskonstanten 73 - Verteilungsvolumina 73 - Clearance 76 - Fläche unter der Hirudin-Plasmakonzentration- 76 Zeit-Kurve - Renale Eliminationshalbwertszeit Renale Clearance Pharmakokinetische Parameter des Hirudins nach 78 subcutaner Injektion - Halbwertszeiten 78 - Verteilungsvolumina 78 - Clearance Fläche unter der Hirudin-Plasmakonzentration- 78 Zeit-Kurve - absorbierter Anteil der subcutanen Dosis 79 - Renale Eliminationshalbwertszeit 79 - Renale Clearance Kumulative Hirudinausscheidung im Urin Zusammenhang zwischen pharmakokinetischen Para- 84 metern und Applikationsmodus 3.5 Zusammenhang zwischen pharmakokinetischen Para- 85 metern und Dosis nach subcutaner Injektion 3.6 Zusammenhang zwischen pharmakokinetischen Para- 85 metern und dem Geschlecht der Versuchspersonen 4 Pharmakodynamik Gerinnungsparameter 87 - PTT 87 - Thrombinzeit 87 - Quick-Test Einfluß der Hirudininjektion auf das Blutbild 96 - Leukozyten 96
6 - Thrombozyten 96 - Hämoglobin 96 - Hämatokrit Nebenwirkungen Immunologische Nachuntersuchungen 97 5 Bewertung 99 III Versuche zum Nachweis einer Sensibilisierung 102 (Immunisierung) von Pavianen durch natürliches und rekombinantes Hirudin 1 Einführung Renale Hirudinausscheidung Serum-Untersuchung auf Hirudin-Antikörper Histamin-Release-Test Direkter Haut-Test Leukozyten- und Thrombozytenzahl Bewertung 119 IV Applikation von Hirudin beim Schwein Einführung Versuchsreihe: Versuche zum pharmakologi- 120 sehen Verhalten von Blutegel-Hirudin beim Schwein 2 Ergebnisse Hirudin-Plasmakonzentrationen Gerinnungsparameter Renale Hirudinausscheidung 123
7 3 Pharmakokinetik des Hirudins beim Schwein Vergleich der pharmakokinetisehen Parameter 124 von Hirudin bei Mensch und Schwein 2. Versuchsreihe: Wirkung von rekombinantem 127 Hirudin bei experimentell erzeugter Sepsis 1 Einführung Ergebnisse Hirudin-Plasmakonzentrationen Renale Hirudinausscheidung Bewertung 132 D ZUSAMMENFASSUNG 133 E ANHANG 137 I Hirudingehalt in den Urinproben, gesammelt nach 137 Injektion beim Menschen II Pharmakokinetische Parameter des Hirudins nach 141 intravenöser Gabe (Einzelwerte) III Hirudin-Plasmakonzentration-Zeit-Kurven nach 142 intravenöser Injektion IV Pharmakokinetische Parameter des Hirudins nach 143 subcutaner Gabe (Einzelwerte) V Hirudin-Plasmakonzentration-Zeit-Kurven nach 146 subcutaner Gabe ' VI Zusammenhang zwischen Hirudin-Plasmakonzentration 149 und.gerinnungsparametern beim Menschen nach subcutaner und intravenöser Gabe VII Blutbild beim Menschen nach der Hirudinapplika- 157 tion VIII Hirudingehalt in den Urinprbben beim Pavian, ge- 169 sammelt nach intravenöser Injektion
8 F LITERATURVERZEICHNIS 174 G ABKÖRZUNGSVERZEICHNIS 182 Lebenslauf
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