Präzision in der Gelelektrophorese für die Pharmazeutische Qualitätskontrolle
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- Guido Carsten Roth
- vor 6 Jahren
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1 Präzision in der Gelelektrophorese für die Pharmazeutische Qualitätskontrolle Von der Fakultät für Lebenswissenschaften der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Dissertation von Simone Schröder aus Stadthagen
2 Inhaltsverzeichnis Vorveröffentlichungen der Dissertation Danksagung Symbole Abkürzungen i iii xii xv 1 Einleitung Gelelektrophorese von Proteinen Theoretische Grundlagen Elektrophoretische Mobilität Elektroendosmose Instrumenteller Aufbau Geräteaufbau Gelmedien Trenntechniken Diskontinuierliche Elektrophorese (Disk-Elektrophorese) SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese(SDS-PAGE) Isoelektrische Fokussierung (IEF) Zweidimensionale Gelelektrophorese (2-DE) Anwendung der Gelelektrophorese Bewertung von Analysenmethoden Präzision Signal-zu-Rausch-Verhältnis Detektionsgrenze / Bestimmungsgrenze Linearität Statistische Beurteilung von Analysenergebnissen F-Test Ausreißertests Varianzkomponenten 47 2 Aufgabenstellung 49 VII
3 3 Analyse der Technik der 2-DE Arbeitstechnik Detektionsmethoden Coomassie-Färbung Silberfärbung Fluoreszenz-Farbstoffe Radioaktive Markierung Difference Gel Electrophoresis (DIGE) Vorüberlegungen IPG-Streifen Äquilibrierung Scan-zu-Scan Variabilität Hintergrundsignal Analytiker Zusammenfassung 72 4Detektion Native Fluoreszenz Prinzip der Detektion Experimenteller Aufbau Native Fluoreszenz von 1D-Gelen Umsetzung des experimentellen Aufbaus zur Nativen Fluoreszenz- Detektion Elektrophoretische Bedingungen für die Mikrogele Abstimmungen für die Laserdetektion NIR-Imaging System Vorteile der NIR-Detektion Leistungsfähigkeit des Odyssey Imaging Systems Präzision Linearität Vergleich mit Fluoreszenz-Farbstoffen Zusammenfassung 99 5 Ausreißertests 100
4 5.1 Ausreißerproblematik Ausreißertests Dixon Grubbs Nalimov Box-Plot Shapiro-Wilk-Test Mediän Absolute Deviation (MAD) nach Huber Datensätze Die Wahl der geeigneten Irrtumswahrscheinlichkeit ROC-Kurven Ermittlung von ROC-Kurven Analyse der Ausreißertests mit Hilfe der ROC-Kurven Bewertung der Ausreißertests Bootstrap-Verfahren Das Prinzip des Bootstrap-Verfahrens Bewertung der Datensätze mit Hilfe des Bootstraps Versuchsdesign Plackett-Burman-Versuchsdesign Aufstellung des Plackett-Burman-Versuchsdesigns Bewertung der Einflussfaktoren Ergebnisse und Diskussion des Plackett-Burman-Versuchsdesigns Zusammenfassung und Ausblick Experimenteller Teil Geräte und Software D-Gelelektrophorese-System D-Gelelektrophorese-System Mikrogele Scannerund Detektoren 144
5 8.1.5 weitere Geräte Software 8.2 Reagenzien und Chemikalien 8.3 2D-Gelelektrophorese Probenvorbereitung Isoelektrische Fokussierung Äquilibrierung SDS-PAGE Detektion D-Gelelektrophorese Untersuchung des Gelhintergrundes Probenvorbereitung SDS-PAGE Umsetzung dernativen Fluoreszenz-Detektion Coomassie-Färbung nach Kang Native Fluoreszenz-Detektion NIR-Detektion Probenvorbereitung SDS-PAGE Coomassie-Färbung Sypro Ruby-Färbung Deep Purple Färbung Plackett-Burman-Versuchsdesign Probenvorbereitung SDS-PAGE Detektion IHa Anhang Präzisionen und Signal-zu-Rausch-Verhältnisse der verschiedenen Detektoren und Farbstoffe Berechnungen zum Plackett-Burman-Versuchsdesign ß-Galactosidase Phosphorylase B
6 9.2.3 BSA Glutamatdehydrogenase Laktatdehydrogenase Carboanhydrase Trypsin Inhibitor Literaturverzeichnis Lebenslauf 189
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