Identifizierung der Proteasen. des Kakaosamens (Theobroma cacao L.)

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1 Identifizierung der Proteasen des Kakaosamens (Theobroma cacao L.) Von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Dissertation von Heinrich Heinrichs aus Wittingen

2 Inhaltsverzeichnis Einleitung. Ausgangspunkt der Arbeit und Problemstellung.2 Ziel und Vorgehensweise dieser Arbeit.3 Benennung der Proteasen Seite Material und Methoden Samenmaterial Sämlingsanzucht Aufbereitung der Kakaosamen Trocknung und Entfettung Herstellung von Acetontrockenpulver Niedersalz-Hochsalz-Extraktion des Acetontrockenpulvers Phenyl Sepharose-Chromatographie Gelfiltration durch Sephacryl S-300 Affinitätschromatographie mit Pepstatin-A-Agarose (Sigma) Inkubationen der Proteasen mit verschiedenen Substraten Inkubationen von AcTP zur Autolyse Inkubationen mit Samenprotein Inkubationen mit Fremdproteinen als Substrat Inkubationen von Exoproteasen des Kakaosamens mit synthetischen Substraten Hemmung der Proteasen aus dem Acetontrockenpulver von Kakaosamen Identifizierung und Bestimmung der Aminosäuren durch HPLC Trennung der proteolytisch erzeugten Peptide durch HPLC Analyse von TCA-löslichen Proteolyseprodukten durch die Bestimmung von a NH2-Stickstoff Bestimmung durch Ninhydrin Bestimmung durch TNBS Proteinbestimmung

3 2.9. Proteinbestimmung nach Bradford Proteinbestimmung nach der Biuret-Methode 2 2. Elektrophoresen SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese Zymogramm-Elektrophorese Herstellung des Acrylamid-BSA-Konjugates PAGE mit BSA-konjugierten Gelen Inkubation der Zymogramme zum Nachweis der Proteasen Gradient-PAGE unter nicht-denaturierenden Bedingungen 29 3 Ergebnisse Charakterisierung der Proteasen in ungekeimten Kakaosamen Exoproteasen in ungekeimten Samen Charakterisierung der Carboxypeptidase in ungekeimten Samen Charakterisierung der LEUPA-Aminopeptidase in ungekeimten Samen Endoproteasen in ungekeimten Samen Charakterisierung der Aspartylprotease Charakterisierung einer Cysteinproteinase in ungekeimten Samen Proteasen der unreifen Samen Morphologische Veränderungen der Kakaosämlinge im Verlauf der Keimung Morphologische Veränderungen reifer Samen Vergleich des Keimungsverhaltens von Samen nach 40 und 60 Tagen der Entwicklung Abbau des Speicherproteins während der Keimung Proteingehalt der Kotyledonen der Kakaokeimlinge Proteasen in den Kotyledonen von Kakaokeimlingen Die Aktivität der Aspartylproteinase in den Kotyledonen von Kakaokeimlingen Pepstatin-insensitive Endoproteinaseaktivität im Verlauf der Keimung 80

4 in Selektive Hemmung der Pepstatin-insensitiven Endoproteasen, die im Verlauf der Keimung gebildet werden Bestimmung des ph-optimums der Cysteinprotease in den Kotyledonen Tage (Stadium II) alter Keimlinge Carboxypeptidasen im Verlauf der Keimung Zusammenfassende Betrachtung der Proteaseaktivitäten sowie des Abbaus des Samenproteins im Zuge der Keimung /«-viwo-abbau des Samenproteins durch die Proteasen der Kotyledonen von Kakaokeimlingen Reinigung und Charakterisierung des nativen Speicherglobulins aus Kakaokotyledonen Hydrophobe Chromatographie des Speicherglobulins ungekeimter Kakaosamen an Phenyl Sepharose Gelchromatographie des Speicherglobulins auf einer S-300 Sephacryl-Säule Verhalten der Struktur des 7S-Globulins unter Hochund Niedersalzbedingungen /n-wfro-abbau von 7S-Globulin durch die Proteasen des Kakaosamens Abbau von Kakao-7S-Globulin durch die Endoproteasen aus den Keimstadien Abbau des Kakao-7S-Globulins durch die Aspartylprotease 3.9 Isolierung von Speicherglobulin aus den Kotyledonen der Keimlinge zu Beginn des Stadiums II Diskussion Endoproteasen des Kakaosamens Aspartylproteinase Cysteinproteinasen Exoproteasen

5 IV 4.3 Der recalcitrante Kakaosame: Morphologische und physiologische Veränderungen des Sämlings während der Keimung Proteolyse des Samenproteins in vitro und in vivo 8 5 Zusammenfassung 30 6 Literaturverzeichnis 34 7 Anhang 50