Biochemisches Praktikum

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1 Heinz Gräser Biochemisches Praktikum Studienbuch für Biologen, Chemiker, Pharmazeuten und Mediziner im 2. Studienabschnitt Friedr. Vieweg + Sohn Braunschweig C. F. Winter'sche Verlagshandlung Basel

2 Inhalt 0. Verwendete und gebräuchliche Abkürzungen und benutzte Symbole Bedingungen und Methoden Allgemeines zum biochemischen Praktikum Qualitative Nachweise einzelner Stoffe oder einer bestimmten Stoffgruppe Quantitative Bestimmungen durch Ermittlung von Relativ- oder Absolutwerten Versuchsdurchführung Vorbereitung Durchführung des Versuches Meßprotokoll Auswertung des Versuches Anlage des Protokolls Testatanforderungen Stoff komplexe zum Abschlußtestat Einige Richtlinien über den Arbeitsschutz im biochemischen Praktikum Die wichtigsten Arbeitstechniken Zentrifugation Dialyse Chromatographie Adsorptionschromatographie als eine Form der Säulenchromatographie Verteilungschromatographie als Säulen- oder Papierchromatographie Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von DEAE Gelfiltration Elutionschromatographie Gradientenelution Elektrophorese und verwandte Methoden Spektralphotometrie und Spektralkolorimetrie Die Funktionsweise eines Spektralphotometers Isotopenmethoden in der Biochemie 31

3 8 Inhalt Bezugssysteme, Dimensionen und Definitionen Meßmethoden und Strahlungsmeßgeräte Kohlenhydrate Chemische Eigenschaften der Zucker Das Verhalten der Zucker gegen Säuren Farbreaktionen der Zucker in mineralsaurer Lösung 36 MoiJSOH-Reaktion SELiWANOir-Reaktion RoTHENirrssER-Reaktion Benzidin-Reaktion auf Pentosen Orcin-Reaktion auf Pentosen nach BIAL 2.2. Quantitative Bestimmungen 39 Mikrobestimmung der Glucose durch Titration nach HAGEDORN und JBNSEN 2.3. Chromatographische Identifizierung der Zucker in Pflanzengeweben 41 Zuckerextraktion aus Pflanzengeweben Chromatographie der Zuckerextrakte 2.4. Die reduzierende Wirkung der Zucker 43 Reaktion nach FEHLING Reaktion nach COLE Reaktion nach BARFOED 2.5. Polysaccharide 46 Eigenschaften der Polysaccharide Isolierung und Nachweis des Glykogens Quantitative Glykogenbestimmung in der Leber Extraktion und Hydrolyse des Glykogens Glucosebestimmung 3. Lipide (Fette und Lipoide) Fettextraktion mit der Soxhletapparatur Eigenschaften der Fette und ihrer Komponenten 52 Fette Fettsäuren Glycerin 3.3. Bestimmung der Jodzahl Bestimmung der Verseifungszahl Isolierung und Nachweis von Lecithin Isolierung und Nachweis von Cholesterin 59 LiEBERMAKN-BxiROHARD-Reaktion Reaktion nach ZAK 4. Aminosäuren und Proteine Qualitative Nachweise 61 Ninhydrin-Reaktion Biuret-Reaktion MiLLCW-Reaktion Xanthoprotein- Reaktion Schwefelblei-Reaktion HoFKrjsrs-CoLE-Reaktion 4.2. Papierchromatographische Trennung von Aminosäuren und Peptiden Zweidimensionale Aminosäuretrennungen 68 Methode von LEVY und CHTJNG Methode nach Dva, BARTSCH und KAMEN Chromatographische Analyse eines Hydrolysats von Rinderserumalbumin nach LEVY und CHUNG Freie Aminosäuren aus Zea mays nach KAMEN U. a. Ninhyd-Rinreaktion auf Papierchromatogrammen und die quantitative Bestimmung der Aminosäurekonzentration

4 Inhalt Trennung von Serumproteinen durch Papierelektrophorese Proteintrennung durch Agar-Gel-Elektrophorese Trennung von Aminosäuren durch Hochspannungselektrophorese Analyse von Proteinhydrolysaten durch zweidimensionale Dünnsohichtchromatographie Bestimmung der Glycinkonzentration durch Formoltitration nach SÖRENSEN Bestimmung des Protein- und Gesamtstickstoffs (Mikromethode) nach KJBLDAHL Proteinbestimmung mit dem Phenolreagens nach FOLIN und CIOCALTETJ (Methode nach LOWRY) Enzyme Enzymatische Bestimmung der Substratkonzentration Harnstoff Äthylalkohol-Bestimmung nach BONNIOHSEN Die Messung der Enzymaktivitäten und Coenzym-Bestimmungen Die Spaltung der Amylose durch Amylase Katalase 92 Bestimmung der Katalase-Aktivität in der Milch durch jodometrische Titration Berechnung der Katalase-Fähigkeit Peroxidase 95 Bestimmung der Peroxidase-Aktivität in Meerrettichwurzeln Alkoholdehydrogenase (ADH) Bestimmung der Gesamt-Dehydrogenaseaktivität in Zellsuspensionen Isolierung von Niootinamid-adenin-dinukleotid (NAD+) nach LE PAGE Succinatdehydrogenase Phosphatase 104 Aktivitätsbestimmung der Serumphosphatase mit Phenolphthalein-diphosphat nach LQTHABDT und WALTEB Die Photophosphorylierung 106 Isolierung der Chloroplasten aus Spinatblättern Bestimmung der Chlorophyllkonzentration Kolorimetrische Phosphatbestimmung Bestimmung der Photophosphorylierung unter Verwendung von radioaktivem Phosphat 5.3. Ribonuklease Berechnung der Enzymaktivität r2. Ribonukleasen der höheren Pflanzen 111 Isolierung der Ribonuklease I aus Tabakblättern 5.4. Trypsin Bestimmung der Pepsin-Aktivität nach ANSON Isolierung von Coenzym A Bestimmung von Coenzym A nach KAPLAN und LIPMAN Vitamine und Hormone Provitamin A (0-Carotin) Vitamin B x (Thiamin) 125 Thiaminbestimmung nach BUKIN

5 10 Inh 6.3. Der Vitamin-B a -Komplex Pantothenat 1 Bestimmung von Pantothensäure Niootinsäure und Nicotinsäureamid Vitamin C (L-Ascorbat) Adrenalin : Charakteristische Adrenalin-Reaktionen 7. Purine, Pyrimidine und Nukleinsäuren 7.1. Die Komponenten der Nukleinsäuren 7.2. Absorptionsspektren von Purinen und Pyrimidinen 7.3. Ermittlung der Extinktionskoeffizienten Der molare Extinktionskoeffizient (e) Konzentrationsberechnungen über den molaren Extinktionskoeffizienten Spektralphotometrisohe RNA-Bestimmung Spektralphotometrische RNA-Bestimmung nach OGTTR und ROSEN, variiert nach MUNSOHE und WOLLGIEHN 7.5. Isolierung von Nukleohiston aus Kalbsthymus nach ZTJBAY und DOTY 7.6. Pflanzliche Nukleohistone Die Isolierung von Nukleohiston des Weizenkeimlings 7.7. Quantitative DNA-Bestimmung mit Diphenylamin nach BTJRTON 7.8. Isolierung hochmolekularer DNA aus Bakterien 7.9. Isolierung von Nukleoprotein nach MIBSKY und POLLISTER Isolierung von Nukleoprotein Präparation von DNA aus dem Thymus- Nukleoproteid nach SIGNER und SCHWÄNDE» UV-Absorption der DNA Schmelzdiagramm der DNA nach MANDEL und MARWUR Nukleinsäurefraktionierung nach der MAK-Methodik Nukleinsäureextraktion aus etiolierten Keimlingen von Zea mays Präparative Gewinnung und Reinigung der Nukleinsäuren Nukleinsäurefraktionierung auf der Methylalbumin-Kieselgur-Säule Die Bestimmung der Nukleotidzusammensetzung der rrna von Zea-mays- Keimlingen Die ribosomale Ribonukleinsäure (rrna) Die Isolierung der ribosomalen RNA aus tierischem Gewebe (variiert nach KIRBY) Fraktionierung der rrna durch Dichtegradientenzentrifugation Isolierung der trna aus Rattenleber nach CANTONI und RICHARDS Abbauprodukte von Purinen und Pyrimidinen Harnsäure Harnsäure-Isolierung aus dem Harn Allantoin und Allantoinsäure Ammoniakbestimmung nach BERTHELOT 8. Übersichtsliteratur 9. Anhang 10. Sachverzeichnis