Untersuchungen zur Jasmonsäure und strukturverwandter Verbindungen als wichtige Signalstoffe im Elicitierungsgeschehen

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Valentin Walter
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1 3 Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Ludwig-Maximilians-Universität München Untersuchungen zur Jasmonsäure und strukturverwandter Verbindungen als wichtige Signalstoffe im Elicitierungsgeschehen von Wilhelm Brodschelm aus Wegscheid 1995

2 INHALTSVERZEICHNIS I. EINLEITUNG II. MATERIAL UND METHODEN Pflanzliches Material Geräte Chemikalien Chemische Synthesen Jasmonsäure Dihydro-Methyljasmonat Dihydro-Jasmonsäure Methylierung freier Fettsäuren mit Diazomethan Herstellung und Reinigung der 12-Oxo-Phytodiensäure Enzymatische Synthese der 13(S)-Hydroperoxy-9,ll,15- oktadekatriensäure (= 13(S)-Hydroperoxylinolensäure) Enzymatische Umsetzung zur 12-Oxo-Phytodiensäure Isolierung und Reinigung der 12-Oxo-Phytodiensäure Isolierung und Reinigung des a-ketols und y-ketols Präparation des Hefe-Elicitors Elicitierung verschiedener Zellkulturen Mikrotest in Multischalen ' Photometrische Bestimmung des Alkaloidgehalts von Eschscholtzia ca/z/bm/ca-zellkulturen Elicitierung in Kolben 45

3 9. Chromatographische Methoden Dünnschichtchromatographie (DC) Mitteldruckchromatographie (MPLC) Hochauflösende Flüssigchromatographie (HPLC) Gaschromatographie (GC) Radioaktivitätsbestimmung Massenspektroskopische Methoden Chiroptische Messungen (Circulardichroismus) 52 III. ERGEBNISSE Chemische Synthesen von strukturverwandten Verbindungen der Jasmonsäure und 12-Oxo-Phytodiensäure (12-Oxo-PDA) Hydroxy-2-(cw-2'-pentenyl)-cyclopentyl-essigsäure (Cucurbinsäure) [3-Hydroxy-2-(c/.s-2'-pentenyl)-cyclopentyl-]oktansäure [3-Oxo-2-(cw-2'-pentenyl)-cyclopentyl-]oktansäure (OPC 8:0) [3-Oxo-2-pentyl-cyclopentyl-]oktansäure(H4-PDA) O-markierte Jasmonsäure bzw. Methyljasmonat Bestimmung der Konzentration an endogener Jasmonsäure und 12-Oxo-Phytodiensäure in Zellkulturen und pflanzlichem Material Entwicklung einer Methode zur quantitativen Bestimmung von Fettsäuren und organischen Säuren mittels GC-MS Beschreibung der Methode 59 a) Etherextraktion der Zellen 59 b) Aufreinigung der Fettsäuren mittels Festphasenextraktionssäulen (SPE) 60 c) Derivatisierung zum Pentafluorbenzyl-Ester 61 d) Untersuchungen zur quantitativen Derivatisierung von 14 C-Linolensäure mit Pentafluorbenzyl-Bromid 61 e) Reinigung über Kieselgel-Säule (SPE) 62 f) Quantifizierung mittels GC-MS Validierung der Methode 64 a) Spezifität und Richtigkeit des Nachweises 64 b) Präzision und Reproduzierbarkeit 66 c) Linearität und Wiederfindungsrate 68 d) Responsefaktor und Nachweisgrenze 69 II

4 3. Jasmonsäure-Akkumulation bei verschiedenen Zellkulturen/Pflanzen Elicitierung verschiedener Zellkulturen bzw. Pflanzen Kinetischer Verlauf des Jasmonsäure-Anstiegs nach Elicitierung verschiedener Zellkulturen 74 a) Eschscholtzia californica 75 b) Agrostis tenuis 75 c) Phaseolus vulgaris 76 d) Catharanthus roseus 76 e) Taxus baccata 77 f) Petroselinum hortense 77 g) Rauvolfla canescens 78 h) Rauvolfia serpentina Bestimmung der Jasmonsäure-Konzentration nach unterschiedlichen Streßsituationen bzw. nach Zusatz von verschiedenen Elicitoren Jasmonsäure-Gehalt nach unterschiedlichem Streß 81 a) Jasmonsäure-Anstieg nach Verwundung 81 -bei Viciafaba bei Avenasativa 83 b) Jäsmonsäure-Anstieg durch Herbivorie 85 - Interaktion der Pflanze Viciafaba mit dem Fraßfeind Spodoptera littoralis 85 c) Hitzeschock und Kältereiz Elicitoren, die einen deutlichen Anstieg der Jasmonsäure-Konzentration bewirken 89 a) Hefe-Elicitor 89 b) Lactobacillus casei 89 c) Antibiotika Korrelation Elicitorkonzentration und Jasmonsäure-Anstieg Elicitoren, die keinen Effekt auf den Jasmonsäure-Gehalt besitzen a) Phytohormon Abscisinsäure (ABA) 94 b) Phytotoxin Coronatin 96 c) Heptaglucan aus Phytophthora megasperma 98 d) sonstige Elicitoren Stereochemie der nach Elicitierung gebildeten Jasmonsäure Trennung der vier Jasmonsäuremethylester-Isomere Derivatisierung der Carbonylgruppe mit Ethandithiol zumthioketal 108 in

5 5.3. Isomerisierung von c«-methyljasmonat zu frans-methyljasmonat durch Zusatz von Säure oder Base Diastereomerentrennung Bestimmung der absoluten Stereochemie der endogen (de novö) gebildeten Jasmonsäure im Elicitierungsprozeß Physiologische Untersuchungen zur Jasmonsäure und strukturverwandter Verbindungen Verteilung der Jasmonsäure in der Pflanze 119 a) Viciafaba 119 b) Glycine mungo Verteilung der Jasmonsäure in der Pflanze nach Verwundung Effekt von Methyljasmonat und Dihydro-Methyljasmonat auf die Spiralisierung von Ranken 122 a) Bryonia dioica 122 b) Cucumis sativus Struktur-Wirkungs-Beziehungen der elicitierenden Substanzen Elicitierung von Eschscholtzia californica Stamm "AST" mit Methyljasmonat und Dihydro-Methyljasmonat Elicitierung von Eschscholtzia californica Stamm "AST" mit a-ketol, y-ketol und 12-Oxo-PDA Elicitierung von Eschscholtzia californica weißer Stamm mit Hefe-Elicitor, Methyljasmonat, 12-Oxo-PDA, OPC 8:0 und H 4 -PDA Elicitierung von Eschscholtzia californica weißer Stamm mit Dihydro-Methyljasmonat und Cucurbinsäure Untersuchungen zur Linolensäure-12-Oxo-PDA-Jasmonsäure-Kaskade Freisetzung der Linolensäure aus der Plasmamembran durch Hefe-Elicitierung Hemmung der beteiligten Lipoxygenase durch cw-8,ll,14-eicosatrien-5-insäure(etya) Hemmung der Ca 2+ -abhängigen Proteinkinase durch Staurosporin 134 IV

6 8.4. Untersuchungen zur Allenoxid-Cyclase 136 a) Bildung von 12-Oxo-PDA aus der Linolensäure 136 b) Bildung von Dihydro-12-Oxo-PDA aus der Linolsäure Untersuchungen zur Linolsäure-Dihydro-12-Oxo-PDA-Kaskade Freisetzung der Linolsäure aus der Plasmamembran nach Elicitierung 140 a) Nicotiana tabacum 141 b) Rauvolßa serpentina Akkumulation von Dihydro-12-Oxo-PDA nach exogener Applikation von Linolsäure 143 a) Nicotiana tabacum 143 b) Rauvolßa serpentina 'ldentitätsnachweis der gebildeten Dihydro-12-Oxo-PDA mittels GC-MS 146 a) als Pentafluorbenzyl-Ester 146 b) als Methyl-Ester Hinweise auf die enzymatische Bildung der Dihydro-12-Oxo-PDA in Zellkulturen nach Elicitierung 150 a) Nicotiana tabacum 150 b) Welwitschia 151 IV. DISKUSSION 152 V. ZUSAMMENFASSUNG 172 VI. LITERATURVERZEICHNIS 175

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