So bestimmen Sie die Bindung zwischen Myosin und Chlorpromazin
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- Gerd Keller
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1 ülndunc VON PHARUAKA AN ISOLIERTES MYOSIN VON KANINCHEN SKELETT MUSKELN Inaugura]-Dissertation zur Erlanqunq des Doktorqrades der Fakultät Chemie und Pharmazie der Ludwiq-Maximilians-Universität München vorqe1eqt von Alexander von Nieciecki a u s München München 1983 Universitätsbibliothek der Technischen Universität Braunschweig
2 Inhaltsverzeichnis Seite A. Einleitung 1 B. Ergebnisse und Diskussion 6 B.l. Myosin 6 B.l.l. Beschreibung des Myosins 6 B.1.2. Identifizierung des Myosins 8 B Gelchromatografie 8 B.l.?.2. SDS-Polyaerylamid-Gel-Elektrophorese 11 B.l.3. Reinheit und Ausbeute der Myosinprä- 14 paration B.?. Vergleichende Bestimmung der Bindung 17 von Pharmaka mit unterschiedlichen Eigenschaften an Myosin B.2.1. Auswahlkriterien 17 B.2.2. Bindung 21 B Saure Pharmaka 21 B Basische Pharmaka 22 B Neutrale Pharmaka 24 B.2.3. Zusammenhang zwischen Bindung an Myosin und Bindung an Plasma und Muskelhomogenate 26 B.2.4. Zusammenhang zwischen Bindung an Myosin und physikalisch-chemischen Eigenschaften der Pharmaka 30 B.2.5. Zusammenhang zwischen Bindung an Myosin und pharmakokinetischen Parametern 35 B.3. Bindung von Chlorpromazin an Myosin 40 B.3.1. Überprüfung möglicher Einflüsse auf die Bindung 40 B Bestimmung der kritischen Mizellbildungskonzentration von Chlorpromazin 40
3 Sei te B Stabilität des Chlorpromazins während der Dialyse 4? B Einflüsse durch die Durchführung der Gleichgewichtsdialyse 4 2 B.3.2. Reversibilität der Chlorpromazin- Myosin-Wechselwirkung 43 B.3.3. Konzentrationsabhängigkeit der Binrlun g 4 5 B Abhängigkeit von der Ligandenkonzentration 45 B Bestimmung der Bindungskonstanten von Chlorpromazin 46 B Bindungskonstanten von Chlorpromazin an Myosin im Vergleich zu anderen biologischen Strukturen 50 B Konzentrationsabhängigkeit und Konstanten der Bindung von anderen Pharmaka 52 B Gründe für qekrümmte Bindungslinien in der SCATCHARD-Darstellung 53 B Inhomogenität des Liganden als mögliche Ursache für nichtlineares Bindungsverhalten 53 B Abhängigkeit der Bindung von der Myosinkonzentration 54 B.3.4. Bindung von Chlorpromazin an gelchromatografisrh gereinigtes Myosin 57 B.3.5. Temperaturabhängigkeit und Thermodynamik der Bindungsreaktion 59 B.3.6. Einfluß von Veränderungen des Lösungsmittels auf die Bindung 65 B Einfluß der Ionenstärke auf die Bindung 65
4 R B B B B.3.7. B B B.4. B.4.1. T L. Seite Einfluß der Polarität des Lösungsmittels auf die Bindung 67 Einfluß der Wasserstoffionenkonzentration auf die Bindung 69 Verdrängung des Myosins aus seiner Bindung an Myosin 71 Verdrängung durch Chlorpromazin- Derivate 72 Verdrängung durch andere Phenothiazin-Perivate 74 Verdrängung durch Iminodibenzyl-Derivate 75 Verdrängung durch Diazepam 77 Bindungsuntersuchungen mit optischen Methoden 78 Fluoreszenzlöschung am Myosin durch Chlorpromazin 78 B.4.2. Untersuchung der Streulichtintensität 80 B. 5. Diskussion zum Rindungsmechanistnus 82 C. Experimenteller Teil 84 C.l. Präparation von Myosin 84 C.2. Gelchromatografie von Myosin 89 C.2.1. Analytische Gelchromatografie 89 C.2.2. Elutionsparameter 89 C.2.3. Präparative Gelchromatografie 90 C.3. SDS-Poy!acrylamid-Gel-Elektrophorese 91 C.4. Quantitative Proteinbestimmung 95 C.5. Herstellung der Lösungen für Bindungsuntersuchungen 96 C.5.1. Herstellung der Myosinlösungen 96 C.5.2. Herstellung der Pharmakonlösungen 98 C.6. Gleichgewichtsdialyse 99 C.6.1. Dialyse mit VISKING R -Schläuchen 99
5 Se i tc C.6.2. Dialyse mit DIANORM R -Gerät 100 C.6.3. Auswertung der Ergebnisse der Gleichgewichtsdialyse 103 C.6.4. Bestimmung der Reversibilität der Chlorpromazin-Myosin-Wechselwirkung 108 C.6.5. Bestimmung der Bindung bei verschiedenen Temperaturen 108 C.7. Analytik der Pharmaka 109 C.7.1. Radiometrische Bestimmung 109 C.7.2. Hochdruck-Flüssigkeitschromatografie 111 C.7.3. Photometrische Bestimmung von Pharmaka 112 C UV-Absorptionsmessungen 112 C Fluorometrische Bestimmungen 112 C.8. Optische Untersuchungen zur Chlorpro mazin-myosin- Wechselwirkung 113 C.8.1. Messung der Fluoreszenzlöschung am Myosin 113 C.8.2. Streulichtmessung 114 C.9. Sonstige Bestimmungen 114 C.9.1. Messung des ph-werts 114 C.9.2. Bestimmung des Verteilungskoeffizienten 115 C.9.3. Bestimmung der kritischen Mizellbildungskonzentration von Chlorpromazin 116 CIO. Herstellung von Chlorpromazin-Derivaten 116 C Chlorpromazin-Sulfoxid 116 C Chlorpromazin-Methyliodid 116 C.ll. Berechnung der Ionenstärke 117 C.12. Rechnerische Auswertung und Darstellung der Daten 117
6 Seite D. Tabellenanhang 119 E. Zusammenfassung 125 F. Literatur 128 G. Lebenslauf 1^3
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