Dissenation der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Ludwig-Maximilians-Universität München

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1 Dissenation der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Ludwig-Maximilians-Universität München Chemisch-analytische und pharmakologische Untersuchungen von pflanzlichen PAF-Antagonisten und Inhibitoren der Thrombozytenaggregation (AUium-Arten, Ginkgo biloba, Pinellia ternata) Bemice Steinke aus New York 1993

2 Inhaltsverzeichnis A. Einleitung 1 Seite B. In vitro Methode zur Untersuchung von Inhibitoren der Thrombozytenaggregation 2 1 Thrombozytenaggregation Trombozytenphysiologie und Thrombozytenfunktionen Thrombozytenaktivierung Aggregation Angriffspunkte für die Beeinflußung der Thrombozytenaggregation 3 2 In vitro Testmethoden S 3 Turbidimetrische Messung der Thrombozytenaggregation Methodik Experimentelle Parameter Standardbedingungen, Blutentnahme Kontrollmessungen Inkubationsmedium ph-wert Temperatur Optimierung und Validierung der Methode Verwendbare Lösungsmittel Indifferente Drogenbegleitstoffe Reproduzierbarkeit und Validierung der Methode Fehlerquellen Diskussion 17 4 Antiaggregatorische Aktivität von Verbindungen aus AUium-Arten und von AIIium-Extrakten lg 4.1 Bisher bekannte antiaggregatorische Verbindungen aus Allium-Arten Hemmung der Thrombozytenaggregation durch Knoblauch- und Bärlauch-Extrakte 24

3 4.3 Hemmung der Thrombozytenaggregation durch Zwiebel-Extrakte Vergleich von Knoblauch-, Bärlauch- und Zwiebel-Extrakten Diskussion 34 C. Biologie und Analyse von PAF-Antagonisten 35 1 Der Mediator PAF Metabolismus Zelluläre Wirkungen Pathophysiologie PAF-Rezeptor PAF-Antagonisten Nicht-spezifische Hemmung Spezifische Hemmung Synthetische PAF-Antagonisten Naturstoffe mit PAF-antagonistischer Wirkung Bisher bekannte Struktur-Wirkungs-Beziehungen Ginkgolide Lignane Cumarine Zusammenfassung ' 57 2 Screening von Arzneipflanzen nach PAF-Äntagonisten und Thrombozytenaggregationshemmern In vitro Testmethoden für das Screening von PAF-Antagonisten Modifizierung des etablierten Testsystems für das Screening von PAF-Antagonisten Verwendete Thrombozytenspezies PAF-Konzentration Spezifität des Wirkmechanismus "Bewertungsschlüssel" für die Wirkstärke Screening ausgewählter Pflanzenextrakte Screening verschiedener pflanzlicher Inhaltsstoffe 67-

4 3 Biologische Wirkwertbestimmung verschiedener Ginkgo-Extrakte Ginkgo biloba Extrakte und Handelspräparate Zusammensetzung eines Ginkgo-Spezialextrakts Pharmakologie und Indikationen Begründung für die Entwicklung einer biologischen Wirkwertbestimmung von Ginkgo-Extraktpräparaten Bisherige Qualitätsbestimmungen von Terpenen in Ginkgo-Extrakten Voraussetzungen und Strategie für die Entwicklung einer biologischen Standardisierungsmethode Methode zur in vitro Bestimmung des biologischen Wirkwerts Meßanordnung Spezifität der Ginkgolid-Wirkung Ermittlung des Wirkwerts als äquieffektiver Ginkgolid B-Gehalt Biologische Wirkwerte verschiedener Ginkgo-Extrakte Standardisierungsvorschlag Umrechnung des äquieffektiven Ginkgolid B-Gehalts auf den Gesamtginkgolidgehalt Vergleich biologisch bestimmter und chemisch-analytisch ermittelter Ginkgolidgehalte Experimentelle Untersuchungen zur Kombinationswirkung von Ginkgoliden Diskussion 96 D. Chemische und pharmakologische Untersuchungen von PineUia ternata (Thunb.) Breit Allgemeine Übersicht Systematik Botanische Beschreibung Volksmedizinische Verwendung Bisher bekannte Inhaltsstoffe 101

5 2 Phytochemische und pharmakologische Untersuchungen Voruntersuchungen Extrakte DC-Screening HPLC-Fingerprintanalyse Pharmakologische Voruntersuchungen Isolierung lipophiler Inhaltsstoffe durch "bioguided fractionation" HO Strukturaufklärung der Lignane Strukturaufklärung von Pll ((+)-Lariciresinol) Strukturaufklärung von P13 ((-)-Pinoresinol) Strukturaufklärung der Phenylpropan-Verbindungen Strukturaufklärung von P8 (Coniferylalkohol) Strukturaufklärung von P12 (Dehydrodiconiferylalkohol) Isolierung hydrophiler Inhaltsstoffe durch "bioguided fractionation" Strukturaufklärung von P3 (Adenosin) Strukturaufklärung von P2 (Adenin) Strukturaufklärung der Flavon-C-glykoside P7 (Vicenin-1) und P9 (Corymbosid) Identifizierung von Pflanzensäuren Untersuchung des hämolyü'schen Prinzips Prüfung auf irritierende Wirksubstanzen Pharmakologie der isolierten Verbindungen Eigene pharmakologische Untersuchungen Diskussion Lignane Adenosin Charakterisierung des Inhaltsstoffmusters zur Identitätsprüfung und Qualitätsbeurteilung Vergleichende DC-Untersuchungen verschiedener Drogenmuster Vergleichende HPLC-Untersuchungen verschiedener Drogenmuster Diskussion 149 E. Zusammenfassung 150

6 Experimenteller Teil Seite 1 Herkunft des Drogenmaterials, der Extrakte, Fertigpräparate und Vergleichssubstanzen 1.1 Allium Knoblauch- und Bärlauch-Extrakte Zwiebel-Extrakte Vergleichssubstanzen 1.2 Ginkgo biloba Ginkgo-Extrakte Fertigpräparate Vergleichssubstanzen 1.3 Drogen und Reinsubstanzen für das in vitro Screening Drogen Reinsubstanzen 1.4 Pinellia ternata (Thunb.) Breit Droge Vergleichssubstanzen Pharmakologische Untersuchungen In vitro Testsystem für antiaggregatorische und PAF-antagonistische Wirkstoffe (Thrombozytenaggregationshemmtest) Chemikalien und Referenzsubstanzen Stammlösungen Modifizierter Tyrode-Puffer Herstellung der Prüflösungen Blut Spender Enmahmetechnik Thrombozytenpräparaü'on Bestimmung der Thrombozytenzahl Testdurchführung Ermittlung der IC S0 -Werte 161

7 Chemisch-analytische Untersuchungen Allgemeine Arbeitsmethoden Spektroskopische und physikalische Methoden Optische Drehung UV-Spektroskopie IR-Spektroskopie Massenspektrometrie 'H-NMR-Spektroskopie Chromatographische Arbeitsmethoden Dünnschichtchromatographie (DC) Säulenchromatographie Mitteldruckflüssigchromatographie (MPLC) Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) Chemische Methoden Hydrolysen Modifizierte Permethylierung nach Brimacombe Spezielle Arbeitsmethoden Phytochemische Untersuchung von Pinellia ternata (Thunb.) Breit Extraktion Isolierung der lipophilen Inhaltsstoffe Isolierung der hydrophilen Inhaltsstoffe DC-Analyse und HPLC-Fingerprintanalyse zur Idenütäts- und Qualitätsbeurteilung Gaschromatographische Gehaltsbestimmung der Ginkgolide aus Ginkgo-Extrakten Gaschromatographische Bedingungen Probenvorbereitung Referenzlösungen Auswertung Physikalische Daten (+)-Lariciresinol (-)-Pinoresinol Coniferylalkohol Dehydrodiconiferylalkohol 179

8 3.3.5 Linolsäure Adenosin Adenin Corymbosid Vicenin G. Literaturverzeichnis 182