Massenspektrometrie: ESI- und MALDI-MS

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1 Massenspektrometrie: ESI- und MALDI-MS 1. Massenspektrometrie Allgemeine Einführung Wichtige Komponenten Gerätetypen 2. Ionisierungstechniken Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung (MALDI) Elektrospray-Ionisierung (ESI) HPLC-Kopplung 3. Peptid- und Proteinanalytik Massenbestimmung Sequenzanalyse Weiterführende Literatur 1. Jürgen H. Gross, Mass Spectrometry, Springer Verlag ISBN Wolf D. Lehmann, Massenspektrometrie in der Biochemie, Spektrum Verlag ISBN

2 Massenspektrometrie - Eine kurze Einführung wichtiger Bestandteil der instrumentellen Analytik Chemie: ab 1960 Strukturaufklärung organischer Verbindungen Massenspektrometer (MS) Apparat, der aus einer Substanzprobe einen Strahl gasförmiger Ionen erzeugt und deren m/z-verhältnis bestimmt Ionisierung Vorgang der Ionenbildung positiv oder negativ geladene Ionen K Positiv- bzw. Negativ-Ionenmodus Abspaltung oder Anlagerung von Elektronen, Protonen oder anderen Ionen (z.b. Alkaliionen) z.b. Radikalkationen und -anionen: M +, M - Quasimolekülionen: [M+H] +, [M-H] -, [M+Na] +, usw. auch: [M+2H] 2+, [M+3H] 3+ usw. Ionenstrom Pro Zeiteinheit gebildete Menge an verschiedenen Ionen Gesamt- oder Totalionenstrom Summe aller Ionenströme -67-

3 Terminologie Ionisierungspotential (IP) oder Ionisierungsenergie (I) Energie zur Erzeugung von Ionen; z.b. I(CH 3 OH) Erste Ionisierungsenergie Entfernung eines Elektrons aus dem höchsten besetzten Orbital des elektronischen Grundzustands eines neutralen Teilchens (Atom, Radikal, Molekül) Ionisierungsenergie: Einheit meist Elektronenvolt (ev) Die Energie, die ein Elektron beim Durchlaufen einer Potentialdifferenz von 1 V aufnimmt 1 ev = 1, J IP der meisten Elemente: IP organischer Verbindungen: 5 bis 20 ev 8 bis 13 ev -68-

4 Terminologie II MS bestimmt nicht die Masse eines Moleküls sondern das Verhältnis aus Masse und Ladung eines Ions (m/q) Praktischer Gebrauch m in atomare Masseneinheiten (1 u = 1, g) q=z e 0 in Elementarladungen (1 e 0 =1, C) Einheit: u/e 0 = 1, gc -1 nach IUPAC: m/z Beispiel Iod: I + m = 126,9044 u z=1 e 0 m/z 126,9044 (exakte Masse) nominelle Masse: C 14 H 10 m/z 89 (= 178/2) Natürlich vorkommende Elemente Meist Gemische aus Isotopen Beispiel: 1 H 2 H (D) 35 Cl 37 Cl 75,5% zu 24,5% Anmerkung Atommasse: mittlerer Massenwert des natürlichen Isotopengemischs z.b. 79 Br und 81 Br je 50,5% zu 49,5% Mittelwert:

5 Apparativer Aufbau - I Prinzipieller Aufbau eines Massenspektrometers Je nach Art der Ionisierung können Einlasssystem und Ionenquelle auch kombiniert werden Einlasssysteme 1. Probe wird verdampft und dann ionisiert 2. Ionen werden aus kondensierter Phase in die Gasphase überführt 3. Gelöste Probe wird in einem feinen Nebel versprüht und die Ionen treten aus den Tröpfchen in die Gasphase über Ionenquellen FAB EI CI ESI MALDI (Fast atom bombardment) (Elektronenstoß-Ionisierung, electron impact) (Chemische Ionisierung, chemical ionization) (Elektrospray Ionisierung, electrospray ionization) (Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung; matrix-assisted laser desorption ionization) -70-

6 Massenanalysatoren Sektorfeld Quadrupol Flugzeit (time-of-flight) Apparativer Aufbau - II Ionenfalle (Iontrap, Orbitrap) Ionenzyklotron-Resonanz (FT-ICR) oft werden zwei identische oder unterschiedliche (Hybrid- MS) Massenanalysatoren kombiniert Analytische Fragestellungen Einzelsubstanzen: Rückschlüsse auf Struktur möglich Gemisch: Rückschlüsse auf Qualitative und Quantitative Zusammensetzung -71-

7 Ionisierungstechniken - MALDI hat sich historisch aus der LDI entwickelt LDI: direkte Ionisierung durch Photonen (Laser) MALDI: 1. Matrix-Moleküle werden durch (UV-) Laserstrahl angeregt 2. Matrix überträgt die Energie auf die im Kristall eingebauten Analytmoleküle 3. Analytmoleküle werden desorbiert und ionisiert (1 Schritt!) (Eventuell auch bereits in Kristall ionisiert!) 4. Matrixmoleküle protonieren als Säuren die Analytmoleküle (Säure/Base-Reaktion!) Ionen werden mit elektrischem Feld extrahiert und beschleunigt Laserimpuls (3-4 ns) mit einer Frequenz von 2 bis 100 Hz je nach Laser Ionen sind in der Regel einfach geladen z.b. [M+H] + Proteine > 30 kda auch höher geladen -72-

8 MALDI-TOF-MS Ionen im elektrischen Feld beschleunigen aufgenommene Energie: E el =qu=ze 0 U q: Ladung U: Spannungsdifferenz z: Ladungszahl e 0 : Elementarladung umgewandelt in kinetische Energie: E kin =½mv² m: Masse v: Geschwindigkeit E el =E kin K ze 0 U=½mv² K m z e U = v Mit v = L t K m z 2e U = 0 t = const. t 2 L

9 Elektrospray-Ionisierung (ESI) Lösung mit Analyt aus feiner Kapillare unter Umgebungsdruck versprühen An Kapillare liegt eine Spannung von 1 bis 5 kv an Geladene Tröpfchen werden zum MS beschleunigt Lösungsmittel verdampft ( Tropfen trocknen ein ) Protonierte Analytmoleküle werden zum Analysator geleitet [M+nH] n+ -Spezies im Positiv-Ionenmodus [M-nH] n- -Spezies im Negativ-Ionenmodus -74-

10 LC-MS-Kopplung MALDI-MS off-line Kopplung Fraktionen sammeln und auf Probenträger spotten (Kapillar-LC oder größere Flussrate) Eluat direkt auf Probenträger absetzen (nanolc) Matrix vorlegen oder kontinuierlich zumischen (Pumpe) ESI-MS off-line Kopplung Fraktionen sammeln und einzeln analysieren Vorteile: Probe kann auch später analysiert werden Probe kann mehrfach gemessen werden on-line Kopplung Säule direkt über Kapillare an ESI-Quelle koppeln Eluat direkt versprühen und MS aufnehmen Vorteile: chromatographische Auflösung bleibt erhalten keine Probenverluste bei Transfer auch für nanolc möglich (höhere Sensitivität) -75-

11 Beispiele: ESI-MS Peptid Protein -76-

12 Sequenzanalyse - I 1. Ion mit definiertem m/z auswählen K 1 Peptid, alle anderen Ionen verwerfen 2. Peptid fragmentieren (z.b. Stoßzelle) Peptidbindungen brechen K Fragmentionen werden gebildet 3. Fragmentionen detektieren (m/z bestimmen) -77-

13 Sequenzanalyse - II Sequenz wird meist aus den dominierenden b- und y-serien bestimmt Abstände zwischen aufeinander folgenden Ionen entsprechen der Inkrementmasse einer Aminosäure Inkrementmasse = Masse(Aminosäure) - 18 (H 2 O) z.b. y 4 =471,1, y 5 =542,2 K Îm=71,1. Alanin Beispiel: Fragmentierung eines tryptischen Spaltpeptids: [M+2H]

14 Weiterführende Module 1. Trennmethoden (4 SWS, im Sommersemester) Chromatographie, Elektrophorese, Kapillarelektrophorese, Miniaturisierung, mehrdimensionale Techniken 2. Biophysikalische Methoden (4 SWS, im Wintersemester) gemeinsam mit Prof. Dr. N. Sträter diverse Techniken, z.b. MS, IR, UV, CD, Fluoreszenz, Röntgenstruktruanalyse usw. 3. Mass spectrometry (4 SWS, im Wintersemester) Internationale Studiengänge, auch für M.Sc. Chemie offen 4. Vertiefungspraktika zu oben genannten Themenbereichen -79-

15 1 st International Meeting on Antimicrobial Peptides: From native sequences to peptidic drugs Leipzig, August 28, 2008 Confirmed Speakers Dr. Philippe Bulet BioPark d'archamps, Archamps, France Prof. Dr. Renato Gennaro University of Trieste, Trieste, Italy Dr. Hans-Henrik Kristensen Novozymes A/S, Bagsvaerd Denmark Prof. Dr. Lisa Martin Monash University, Melbourne, Australia Prof. Dr. Laszlo Otvos Temple University, Philadelphia, U.S.A. Prof. Dr. John Wade Howard Florey Institute, University of Melbourne, Australia

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