Massenspektrometrie organischer Moleküle. 1. Apparativer Aufbau

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1 Ein Massenspektrometer ist ein Instrument, das aus einer Substanzprobe einen Strahl gasförmiger Ionen erzeugt, diese nach Masse und Ladung trennt und schließlich ein Massenspektrum liefert, aus dem abgelesen werden kann, Ionen welcher Masse in welchen relativen Mengen gebildet worden sind. 1. Apparativer Aufbau Abbildung 1: Schematischer Aufbau eines Massenspektrometers. 1.1 Einlasssysteme Verdampfung der Probe vor der Ionisierung (unpolare bis mäßig polare Substanzen; MW < 1000 g/mol). Ionen werden aus einer kondensierten Phase durch Beschuss mit energiereichen Teilchen oder einem Laser in die Gasphase überführt (mäßig bis sehr polare Verbindungen; < 2500 g/mol bei FAB; < g/mol bei MALDI). Probenlösung wird zu feinem Nebel zerstäubt und aus den Nebeltröpfchen treten Ionen in die Gasphase über (mäßig bis sehr polare Substanzen; MW > ). Indirekter Einlass Die Probe wird in einem heizbaren Vorratsgefäß verdampft. Durch eine feine Öffnung strömt die Substanz dann in die Ionenquelle. Die Massenspektren sind meist gut reproduzierbar, allerdings werden die Substanzen thermisch stark belastet. (Substanzmenge ca. 1 µl) Direkter Einlass Die Probe wird mit einer heizbaren Schubstange durch eine Vakuumschleuse direkt in die Ionenquelle gebracht. Aufgrund des geringen Druckes wird eine geringere Verdampfungstemperatur benötigt als bei indirektem Einlass. Die Verdampfung ist schonender allerdings sind die Spektren aufgrund ungleichmäßiger Verdampfung schlechter reproduzierbar. (Substanzmenge im µg-bereich.) 1

2 1.2 Ionenquellen Elektronenstoßionisation (EI) Die gasförmige Probe wird im Vakuum mit einem Elektronenstrahl beschossen, der meist eine Energie von 70 ev besitzt. Hauptsächlich entsteht das Molekülradikalkation M + (ungeradeelektronisch). Die zur Ionisierung aufzuwendende Mindestenergie entspricht der Energie, die notwendig ist, um das Elektron aus dem höchsten besetzten Orbital zu entfernen (erstes Ionisierungspotential (IP)). Voraussetzung für das EI-Verfahren ist die Flüchtigkeit der Probenmoleküle. A B Abbildung 2: A) Elektronenstoßionisation. Senkrecht zum Molekülstrom wird ein Elektronenstrahl von Glühkathode zu einer Anode beschleunigt wird. B) Ionenbildungsreaktionen für das hypothetische Molekül AB. Chemische Ionisation (CI) In eine geschlossene EI-Ionenquelle wird ein Reaktandgas gebracht, das durch Elektronenbeschuss ionisiert wird. Primärreaktionen im Reaktandgas führen zu reaktiven Reaktandgasionen. Übliche Reaktandgase sind Methan, Ammoniak, und Isobutan. Hauptsächlich entsteht das Quasimolekülion [M+H] + (geradeelektronisch). CH CH 4 CH CH 3 CH 4 + CH H CH CH 4 C 2 H H 2 Protonierung: M + XH + [M+H] + + X (1) Hydridabstraktion: M + X + [M-H] + + XH (2) Anlagerung: M + X + MX (3) Abbildung 3: Quasimolekülionen durch Ionenreaktionen nach chemischer Ionisation. (1) Bevorzugt bei Molekülen mit Heteroatomen. (2) Bevorzugt bei Alkanen. (3) Insbesondere Anlagerung an π-systeme. 2

3 Die Bedeutung der chemischen Ionisation liegt in der gezielten Unterdrückung von Fragmentionen (im Vergleich zur EI bevorzugte Bildung des Quasimolekülions.) der gezielten Ionisation bestimmter Verbindungsklassen (durch Verwendung von NH 3, das seinerseits NH + 4 bildet, werden nur basische Substanzen ionisiert). dem Nachweis bestimmter funktioneller Gruppen. Fast Atom Bombardment (FAB) Zur Ionisation wird die Probe in einer Matrix gelöst und auf einem Target durch Vakuumschleusen in die Ionenquelle eingebracht, wo sie mit Edelgasatomen bombardiert wird (Ar, Xe, Cs + ). Energie des Atom-/Ionenstrahles ist ca. 6-8 kev. Meist werden Quasiionenpeaks beobachtet, die durch Anlagerung von H +, 23 Na + oder 39 K + entstehen. Abbildung 4: Aufbau einer FAB-Ionenquelle. Vorteil der Methode ist die schonende Ionisierung, daher eignet sie sich für schwerflüchtige, leicht zersetzbare Verbindungen. Oberflächenaktive Substanzen dominieren allerdings das Spektrum (größere Mengen anorganischer Salze stören). Das Aussehen des Spektrums hängt weiterhin von der Zusammensetzung der Matrix ab. Zusätzlich können Matrixmoleküle mit der Probe reagieren. Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionisation (MALDI) In Matrix gelöste Teilchen werden mit einem gepulsten Laser bestrahlt. Aufgenommene Anregungsenergie führt zur Desorption. Dabei ist die Matrix so zu wählen, dass sie im Wellenlängenbereich des Lasers absorbiert. Wie beim FAB-Verfahren werden meist Quasiionenpeaks (Anlagerung von H +, 23 Na + oder 39 K + ) beobachtet, manchmal auch mehrfach geladene Ionen. Die gleichen Störeffekte durch die Matrix werden auch im MALDI-Spektrum beobachtet. 3

4 Sprayverfahren (z.b. Elektrospray-Verfahren (ESI)) Das Sprayverfahren basiert auf dem Prinzip der Ionenverdampfung. Hierzu wird die Probe in Lösungsmittel aufgenommen, und die Lösung zerstäubt. Die Nebeltröpfchen enthalten einen Überschuss an positiven oder negativen Ladungsträgern. Durch Verdampfen verlieren sie neutrale Lösungsmittelmoleküle, so dass die Oberflächenladung/cm 2 zunimmt. Ab einem bestimmten Tröpfchenradius wird die Coulomb-Abstoßung so groß, dass die Tröpfchen zerfallen und die Ionen aus den Tröpfchen in die Gasphase austreten, oder hoch geladene Ionen zurückbleiben. Mit Hilfe des Sprayverfahrens können Verbindungen mit hohen Molekulargewichten analysiert werden, da die Ionisierung sehr schonend erfolgt. Es werden einfach geladene [M+H] + Quasimolekülionen gebildet, aber auch mehrfachgeladene [M+nH] n+ Ionen sind nicht selten. Abbildung 5: Prinzip des Sprayverfahrens. 1. Teilweise Entladung der Ionen an Kapillarwand. 2. Ausbildung eines Taylor cone. 3. Tröpfchen enthält je nach angelegter Spannung pos. oder neg. Ionen im Überschuss. 4. Verringerung des Tröpfchenradius => Abstoßung der Ionen 5. Bildung gasförmiger Ionen 6. Gegenelektrode 7. Spray-Strom ~ Konzentration der Ladungsträger in Lösung. 1.3 Ionentrennung - Analysator Zur Trennung werden die Ionen über ein Potentialgefälle beschleunigt, wobei die Geschwindigkeit, v, von der Ladung, e, und der Masse, m, der Ionen sowie der Beschleunigungsspannung, U, abhängt. Der Ionenstrahl wird durch elektrostatische Felder gebündelt, und durch einen Austrittsspalt ein schmaler Streifen herausgeschnitten. 2 m v e U = 2 e U v = 2 m (1) Magnetfeldgeräte (Sektorfeldgeräte) Die Ionen werden in einem Magnetfeld, B, gemäß der Lorentzkraft abgelenkt. Der Ablenkungsradius, r, ergibt sich durch Gleichsetzen von der Lorentzkraft und der Zentrifugalkraft: B e v = m v r 2 m v r = (2) e B 4

5 Durch Einsetzen der Gleichung (1) in (2) ergibt sich: 2m U r = 2 e B m B 2 2 r = (3) e 2U Time of Flight (TOF)- Massenspektrometer Die beschleunigten Ionen treten in ein Flugrohr ein. Aufgrund der unterschiedlichen Massen erreichen leichtere Ionen das Ende des Flugrohrs schneller als schwerere und können so nacheinander registriert werden. Bei moderneren Geräten ist das Rohr gewinkelt gebaut. Die Ionen fliegen in ein elektrisches Feld und werden in einem Winkel reflektiert. Flugzeitgeräte werden gepulst betrieben und eignen sich daher besonders zur Kopplung mit gepulster Ionisation (MALDI gepulster Laser). Quadrupol-Massenspektrometer Ein Quadrupol besteht aus vier parallel ausgerichteten im Quadrat angeordneten Metallstäben. Zwei der Metallstäbe stehen sich also jeweils gegenüber (A und C bzw. B und D). Durch Anlegen einer Wechselspannung zwischen A und C werden positive Ionen beim Passieren in eine Sinusbahn gelenkt. Während der positiven Phase werden sie von den Stäben abstoßen und zur Mitte gelenkt, während sie in der negativen Phase der Wechselspannung zu den Stäben gelenkt werden. Die Wechselspannung wird nun mit einer positiven Gleichspannung überlagert. Für leichte Massen reicht die negative Phase der Wechselspannung aus (aufgrund der geringeren Trägheit), um sie zu den Stäben zu lenken und zu entladen. Größere Massen können in der Mitte gehalten werden. Auf diese Weise sperren die Stäbe A und C für kleine Massen. Umgekehrt wird die Wechselspannung an den Stäben B und D mit einer negativen Gleichspannung überlagert, so dass in analoger Weise die hohen Massen zu den Stäben gelenkt und entladen werden. Daher sperren Stäbe B und D für hohe Massen. B A C D Abbildung 6: Schematischer Aufbau eines Quadrupols. 5

6 Ionenfalle In einer Ionenfalle werden Ionen mittels elektrischer und magnetischer Felder festgehalten. Abhängig von Art und Stärke der einwirkenden Felder kann man gezielt Ionen einer bestimmten Masse gefangen halten. Alternativ kann man sämtliche Ionen in der Falle vorrätig halten und durch Veränderung der Felder Ionen einer bestimmten Masse entnehmen und so den Ionenvorrat gezielt massenaufgetrennt zu scannen. Die Ionenfalle eignet sich daher für die gezielte Untersuchung von Fragmenten (MS/MS-Verfahren). Ionen-Cyclotron-Resonanz (ICR) Massenspektrometer Ionen in einem starken Magnetfeld bewegen sich auf Kreisbahnen. Das m/z-verhältnis ergibt sich aus der Magnetfeldstärke und der Winkelfrequenz (Cyclotronfrequenz). Mit Hilfe der Fourier-Transformation lassen sich auf diese Weise die Massen berechnen. ICR-Geräte haben eine hohe Empfindlichkeit und ein extrem hohes Auflösungsvermögen, das allerdings mit zunehmender Masse abnimmt. 1.4 Detektion Die durch den Analysator getrennten Ionen treffen auf einen Kollektorspalt, hinter dem sich ein Auffänger befindet. Die Intensitäten der Entladungsströme werden mit einem Sekundärelektronenvervielfacher (SEV) registriert. Durch jedes auftreffende Ion werden in der ersten Dynode Elektronen heraus geschlagen, welche zu einer zweiten Dynode hin beschleunigt werden und ihrerseits aus dieser Elektronen heraus schlagen (Verstärkungsfaktor ). 1.5 Auflösung und Fokussierung Ionenstrahlen haben eine endliche Breite. Damit Ionen unterschiedlicher Masse getrennt werden können, dürfen sich ihre Strahlen nur wenig oder gar nicht überlagern. Was mit getrennt gemeint ist, wird unterschiedlich definiert. Für viele Gerätespezifikationen darf das Tal zwischen zwei gleich großen Signalen nicht 10% der Höhe der Signale überschreiten. Eine charakteristische Größe für die Güte der Trennung ist die Auflösung: R = (Im Sektorfeldmassenspektrometer bedeutet ein Auflösungsvermögen von 2000, dass ein Ion der Masse 1999 u von einem Ion der Masse 2000 u unterschieden werden kann ( m = 1) bzw. m m ein Ion der Masse u von dem der Masse 100 u getrennt werden kann.) Die Breite des Ionenstrahles hängt ab von Der Öffnung der Ausrittsspalte Der Richtungsdispersion (die Ionen fliegen nicht exakt parallel) Geschwindigkeitsdispersion einer Ionensorte nach der Beschleunigung 6

7 Der Richtungs- und Geschwindigkeitsdispersion lässt sich durch Fokussierung entgegenwirken. Die divergierenden Strahlen lassen sich bei Magnetfeldgeräten durch geeignete Gestaltung des Feldes (Magnetanalysator) wieder in einem Punkt fokussieren. Auf ähnliche Weise lässt sich die Geschwindigkeitsdispersion durch Vorschalten eines elektrostatischen Sektorfeldes kompensieren. elektrostatischer Analysator S magnetischer Analysator Austrittsspalt der Ionenquelle Kollektor Abbildung 7: Schematische Darstellung eines doppelt-fokussierenden Massenspektrometers. 7

8 2. Analyse des Massenspektrums 2.1 Begrifflichkeiten Isotop: Isotope besitzen die gleiche Kernladung, aber eine unterschiedliche Kernmasse. Sie unterscheiden sich in der Anzahl der Neutronen. Tabelle 1: Isotopenverteilung der organischen Verbindungen. (1u ist der 12. Teil der absoluten Masse eines Kohlenstoffatoms des Isotops 12 C.) Isotop Isotopenmasse [u] Häufigkeit [%] M-1 M M+1 M+2 absolut relativ 1 H H B B C C N N O O O F Si Si Si P S S S Cl Cl Br Br I

9 Abbildung 8: Wichtigste Isotopenmuster. Nominelle Masse / exakte Masse / Molmasse: Die nominelle Masse wird aus den Atommassen ohne Berücksichtigung der Nachkommastellen berechnet. Für die exakte Masse werden die Nachkommastellen der Atommassen berücksichtigt. Die Molmasse wird berechnet mit dem Massenmittel aller Isotope eines Elements (vgl. Periodensystem). Beispiel: Summenformel nominelle Masse exakte Masse Molmasse C 25 H C 50 H C 75 H C 100 H Rinder-Proinsulin hat die Summenformel C 381 H 586 N 107 O 114 S 6. Daher beträgt allein die Wahrscheinlichkeit für 13 C-Isotope 381 x 1.1 = 419 %. Das wahrscheinlichste Molekül enthält demnach vier 13 C-Isotope. 9

10 Abbildung 9: Molekülionenbereich [M+H] + von Rinder-Proinsulin. Molekülion / Quasimolekülion: Das Molekülion entsteht durch Entfernen eines Elektrons aus dem Molekül. Somit ist das Molekülion immer ein Molekülradikalkation (ungeradeelektronisch). Das Quasimolekülion wird durch Anlagerung von Ionen (z.b. H + je nach Ionenquelle) erhalten. Molekülionenpeak: Repräsentiert das Molekül- oder Quasimolekülion. Basispeak: Der Basispeak ist der intensivste Peak im Massenspektrum. Er wird meist normiert auf 100%. 2.2 Bestimmung der Elementarzusammensetzung [a] [b] Wasserstoffgehalt: Aus der ersten Nachkommastelle des Molekülionenpeaks lässt sich die Anzahl der Wasserstoffatome abschätzen. 1 H hat eine Masse von u. Bei sieben H-Atomen ergibt sich eine 1 als Nachkommastelle (7 x = = 7.1). Ab 20 H-Atomen ist die zweite Nachkommastelle eine 2. Hierfür ist eine gute Kalibrierung des gerätes notwendig. Kohlenstoff-Gehalt: Die Intensität des [M+1]-Peaks (bezogen auf den Molpeak als 100%) berechnet sich für organische Verbindungen mit C, H, N und O nach der Formel: I M+1 [%I M ] = n C 13 C% + n H 2 H% + n N 15 N% + n O 17 O% Dabei sind 13 C% usw. die natürlichen Häufigkeiten der Isotope. Da 2 H und 17 O sehr geringe natürliche Häufigkeiten besitzen, und organische Verbindungen normalerweise nicht mehr als 2-3 Stickstoffatome enthalten, kann in der Regel der Kohlenstoffgehalt aus dem [M+1]-Peak abgeschätzt werden. C-Zahl = I M+1 / 1.1 (± 1-2 C-Atome) 10

11 [c] Stickstoffregel: Einfach geladene (ungeradeelektronische) Molekülionen (M + ) mit einer ungeraden Anzahl von Stickstoffatomen (basierend auf 1 H, 12 C, 14 N, 16 O, 32 S, 19 F, 35 Cl, 79 Br, 127 I) besitzen eine ungerade nominelle Masse. Bei gerader Anzahl von N- Atomen ist auch die Molmasse gerade. Bei geradeelektronischen Ionen (z.b. [M+H] + ) ist es genau umgekehrt!!! [d] [e] [f] [g] Vorliegen von Cl und Br: Moleküle, die Chlor oder Brom enthalten, ergeben ein Molekülionen-Dublett. Indiz für das Vorliegen von 127 I, 31 P und 19 F: Ein unerwartet niedriger [M+1]-Peak bei relativ hohem Molekulargewicht deutet auf Iod, Phosphor und Fluor hin (monisotope Elemente). Si-Haltigkeit: Ein unerwartet hoher [M+1]-Peak deutet auf Silicium hin, dann aber in Verbindung mit einem hohen [M+2]-Peak. Auch basische Verbindungen zeigen hohe [M+1]-Peaks durch H-Übertragung. Silizium und Schwefel: Silizium- und Schwefelhaltige Verbindungen zeigen einen intensiven [M+2]-Peak. [h] "Schweratome": Tritt als erste Nachkommastelle beim Molekülionenpeak eine 0, 9 oder 8 auf, so deutet dies auf Schweratome hin (Massendefekt). Ist die Summenformel bekannt lässt sich der Grad der Unsättigung berechnen: U = 1 Σn i + ½ Σn i v i n i = Index des Elements in der Summenformel v i = Bindigkeit des Elements Beispiel: (C 10 H 12 O 2 ) U = 1 ( ) + ½ ( ) = ½ 56 = 5 O O 11

12 2.3 Beispielspektren - Bestimmung der Elementarzusammensetzung A Nr Masse Häufigkeit B Chemische Ionisation mit Methan

13 C Masse I[%] D Nr Masse Häufigkeit

14 E F 14

15 G H Masse %

16 2.4 Fragmentierungsreaktionen Die Wahrscheinlichkeit, mit der das Molekülion in Fragmente zerfällt, ist abhängig von der Stabilität der Fragmente. Aus einem Molekülradikalkation kann durch Abspaltung eines Neutralmoleküls wiederum ein Radikalkation entstehen, oder es zerfällt in ein Radikal und ein geradeelektronisches Kation: M + A + + B M + C + + D Ungeradeelektronische Ionen können also sowohl wieder in ungeradeelektronische oder geradeelektronische Fragmente zerfallen. Aber geradeelektronische Fragmente zerfallen nur wieder in geradeelektronische Fragmente. Die Ionisierbarkeit nimmt in der Reihe n > π > σ ab. Das heißt, freie Elektronenpaare sind leichter ionisierbar als π Bindungen und diese wiederum leichter ionisierbar als σ- Bindungen. Durch Verlust von mehreren Elektronen können mehrfach geladene Ionen entstehen. Da die Auftrennung der Ionen nach m/z erfolgt, werden doppelt geladene Ionen bei der Hälfte des Molekulargewichtes registriert. Alkane n-alkane fragmentieren zu C n H + 2n+1 -Ionen, wobei ein Intensitätsmaximum bei C 3 -C 4 zu beobachten ist und mit steigender C-Zahl die Intensität abnimmt. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die primär gebildeten höheren Alkylionen weiter fragmentieren. Verzweigte Alkane zerfallen bevorzugt an der Verzweigungsstelle, da auf diese Weise stabilere Kationen bzw. Radikale gebildet werden. Abbildung 10: Zerfall von Alkanen am Beispiel von n-oktan. 16

17 Benzyl- und Allyl-Spaltung Aromatische Kerne, Doppelbindungssysteme oder auch isolierte Doppelbindungen begünstigen die Benzyl- bzw. Allyl-Spaltung. Die hohe Intensität der Fragmentpeaks drückt ihre hohe Stabilität aus. Abbildung 11: Benzylspaltung am Beispiel von Butylbenzol. α-spaltung α-bindungen zu benachbarten Heteroatomen werden bevorzugt gespalten, wobei das Heteroatom die Ladung stabilisiert und das Fragment mit dem Heteroatom geradeelektronisch wird. Die α-spaltung findet in einer Zerfallskette meist nur einmal statt, da die homolytische Spaltung einer C-C-Bindung eines Kations, das aus einem Radikalkation entstanden ist, sehr energieaufwendig ist. Abbildung 12: α-spaltung von 2-Butanon. 17

18 McLafferty-Umlagerung Die McLafferty-Umlagerung wird auch β-spaltung mit H-Verschiebung genannt. Dabei wird über einen sechsgliedrigen Überganszustand ein H-Atom aus der γ-position auf ein mindestens doppelt-gebundenes Atom übertragen, wobei gleichzeitig eine Verschiebung der Doppelbindung eintritt und ein Neutralteilchen abgespalten wird. A B Abbildung 13: McLafferty-Umlagerung. Onium-Reaktion In der Onium-Reaktion ist das Heteroatom der Ladungsüberträger. Ein Alkylrest wird von einem Heteroatom abgespalten, auf das dann ein H-Atom übertragen wird. A B Abbildung 14: Beispiel einer Konkurrenzreaktion zwischen McLafferty und einer Onium-Reaktion. 18

19 2.5 Beispielspektren - Fragmentierungsreaktionen I J 19

20 K L Masse I[%] Masse I[%] W ellenzahl [cm -1 ] Durchlässigkeit [%] 20

21 M N 21

22 2.6 Knobelaufgabe Versuchen Sie aus dem Massenspektrum herauszufinden, um welche Verbindung es sich handelt. Das IR-Spektrum zeigt eine starke Carbonylbande und eine C-O-Schwingung. Erklären Sie das Fragmentierungsmuster. 1 Masse I[%] Masse I[%]