Proteomics. Analytik von humanen Serumproteinen mittels 1D-SDS PAGE mit anschließender massenspektrometrischer Identifikation peptide mass fingerprint

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1 Proteomics Analytik von humanen Serumproteinen mittels 1D-SDS PAGE mit anschließender massenspektrometrischer Identifikation peptide mass fingerprint 1. Theorie 1.1 Elektrophorese Der Begriff Elektrophorese beschreibt die gerichtete Wanderung geladener Teilchen in einem elektrischen Feld. Hierbei hängt die elektrophoretische Beweglichkeit der Teilchen von verschiedenen Faktoren, wie zum Beispiel deren Größe und Ladung, ab. Zum Einsatz kommen elektrophoretische Verfahren vor allem bei der Trennung von Proteinen und anderen Makromolekülen wie DNA oder RNA. In den meisten Fällen werden elektrophoretische Auftrennungen in Gelen durchgeführt, man spricht dann von Gelelektrophorese. Ein weiteres elektrophoretisches Verfahren zur Auftrennung von Proteinen ist die isoelektrische Fokussierung (IEF), die Trennung kommt hier durch unterschiedliche isoelektrische Punkte zustande. Der isoelektrische Punkt eines Proteins ist der ph-wert, bei dem seine Nettoladung gleich Null ist. Somit ist die elektrophoretische Beweglichkeit eines Proteins bei diesem ph-wert ebenfalls gleich Null. [1] Eindimensionale Gelelektrophorese (1D-GEL) Die Gelelektrophorese stellt eine sehr effektive Methode zur Trennung von Proteinen und anderen Makromolekülen dar. Eine Mischung geladener Teilchen wandert in einem elektrischen Feld durch ein Gel mit bestimmter Porengröße und wird hierbei aufgetrennt. Zu den meist verwendeten Gelmedien zählen Agarose und Polyacrylamid. Polyacrylamidgele Polyacrylamidgele sind durchsichtige, chemisch inerte und stabile Gele, die durch Copolymerisation von Acrylamid mit dem Vernetzer N,N -Methylenbisacrylamid (Bis) entstehen. Bei

2 Praktikum Instrumentelle Bioanalytik der Polymerisation wird Ammoniumpersulfat eingesetzt, welches bei Zusatz von Radikale bildet und so die Polymerisationn startet. TEMED SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophoresee (SDS-PAGE) Bei der SDS-Page werden Proteine nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Bei der Pro- enthält benvorbereitung erhitzt man die Probe zusammen mit Probenpuffer auf 95 C. Dieser unter anderem Natriumdodecylsulfat (SDS). SDS ist ein anionisches Detergenz, das die Sekundär- und Tertiärstrukturr der Proteine zerstörtt und derenn Eigenladungen sehrr effektiv überdeckt. Es kommt zur Ausbildung vonn negativ geladenen Micellen mit konstantem Masse/ Ladungsverhältnis von 1,4 g SDS/g Protein. Des Weiteren enthält derr Probenpuffer das Reduktionsmittel 2-Mercaptoethanol bzw. Dithiothreitol, um die Disulfidbrücken zwischen Cysteinen zu spalten. Die Trennung erfolgt nun nicht mehr aufgrund von Unterschied en im Ladungszustand, Größe und Form der Proteine in ihrem nativen Zustand, sondern nur nach Molekulargewicht. Durch den Siebeffekt des Gels bewegen sich kleine Proteine schneller durch das Gel, da große Proteinee im Geflecht stärker zurückgehal lten werden. Bei der SDS-PAGE können verschiedene Arten von Gelen eingesetzt e werden. Das meist verwendete diskontinuierlichee System besteht aus zwei Gelen, einem engporigen Trenngel (unten) und einem weitporigen Sammelgel (oben) [siehe Abbildung 1] ]. Die beiden Gele unterscheiden sich in Porengröße, ph-wert kommen als Stapel am Trenngel an undd werden dann dort und Ionenstärke. Das Sammelgel dient der Konzentrierung der Proben, diese aufgetrennt [siehe Abbildung 1]. Diese Methode wird als diskontinuierliche Polyacrylamid- Gelelektrophorese bezeichnet. Sie führt zu schärferen Bandenn und erlaubt größere Proben- volumina als Verfahren mit einem einzigen kontinuierlichen Gel. [1,2] Abbildung 1: Diskontinuierliche Polyacrylamid-Gelelektrophorese [1,2]

3 Praktikum Instrumentelle Bioanalytik Zweidimensionale Gelelektrop phorese (2D-GEL) Die 2D-Gelelektrophorese ist eine hochauflösende Methode zur Auftrennung von komplexen Proteingemischen. Sie ist einee Kombination aus isoelektrischerr Fokussierung und SDS-Poly- acrylamid-gelelektrophorese. In der ersten Dimension werdenn die Proteine einer IEF unter- zweiten zogen und nach ihren isoelektrischen Punkten aufgetrennt. Anschließend wird in derr Dimension eine SDS-PAGE durchgeführ rt bei der Proteine mitt denselbenn pi-werten zusätz- lich nach ihren Molekulargewichten aufgetrennt werden. Abbildung 2 zeigt t ein 2D-Gel. [3] Abbildung 2: 2D-Gelelektrophorese eines Proteinextraktes aus E.Coli [3] Färbetechniken Coomassie-Blau-Färbung nach erfolgter Trennung im Gel zu lokalisieren müssen sie entsprechend ange- Um Proteine färbt werden. Eine sehr verbreitete Methode ist die Färbung mit Coomassie Brilliant Blau R 250. Dies ist ein Triphenylmethanfarbstoff, der unspezifisch h an fast alle Proteinee bindet. Bei der Färbung mit Coomassie Brillant Blau R 250 wird eine NachweisgreN enze von 0, 1 2 µg Protein pro Bande erreicht. Durch die in der Färbelösung enthaltene Essigsäure werden die Proteinee zudem im Gel fixiert. [1,2]

4 1.2 Massenspektrometrie Überblick Die Massenspektrometrie ist eine Untersuchungstechnik zur Bestimmung der Molmasse freier, gasförmiger Ionen im Hochvakuum. Der prinzipielle Aufbau eines Massenspektrometers wird in Abbildung 3: wiedergegeben. Ionenquelle (Ionisierung) Massenanalysator (Ionentrennung) Detektor (Ionennachweis) Matrixunterstützte Laser-Desorption/ Ionisation (MALDI) Elektrospray-Ionisation (ESI) und Nano-Elektrospray-Ionisation (nesi) Fast Atom Bombardment (FAB) Chemische Ionisation (CI) Chemische Ionisation bei Atmosphärendruck (APCI) Elektronenstoß-Ionisation (EI) Flugzeitanalysatoren (TOF) Quadrupole Elektrische Ionenfallen (ion traps) Elektromagnetische Ionenfalle (Ionencyclotron) Magnetisches Sektorfeld Elektrisches Sektorfeld Konversionsdynode mit Sekundärelektronenvervielfacher (SEV) Vielkanalplatte (multichannel plate) Abbildung 3: Komponenten eines Massenspektrometers [1] In der Ionenquelle wird aus einer Probe ein Strahl gasförmiger Ionen erzeugt. Diese werden in einem Massenanalysator hinsichtlich des Masse/Ladungs-Verhältnisses aufgetrennt. In einem nachgeschalteten Detektor wird mit entsprechender Datenverarbeitung ein Massenspektrum erzeugt. [1]

5 Praktikum Instrumentelle Bioanalytik Ionisierungstechniken Zur Ionisierung von Molekülen stehen verschiedenee Methoden zur Verfügung [vgl. Abbildung 3], durch die Aufnahme oder Abgabe eines Protons oder Elektrons werden die Analyt- (Elektronenstoß-Ionisation, EI), mit Atomen oder Ionen (Fast atom bombardement, FAB) moleküle ionisiert. Hierzu beschießt man die Probe beispielsweise mit Elektronen oder mit Photonenn (Laser-Desorption/Ionisation, LDI). Ein anderer Weg zur Erzeugung von Ionen ist das Versprühen einer flüssigen Phase in einem elektrischen Feld (Elektrospray- Ionisation, ESI) [4, 1]. Matrixunterstütztee Laser-Desorption/Ionisation (MALDI) Die MALDI-MS zählt zu den weichen Ionisierungsmethoden, da d die Probenmolekülee bei der Ionisierung nicht in Fragmente zerfallen. Bei der Ionisierung entstehen e vorrangig Ionen der Form [M+H] +. Das Prinzip eines MALDI- Prozesses ist in Abbildung 4 dargestellt. Abbildung 4: Prinzip des MALDI-Prozesses [1] Proben, die mittels MALDI analysiert werden, müssen zunächst mit einer Matrix gemischt und anschließend auf eine Edelstahlplatte als Probenträge er aufgebracht werden. Beim

6 Praktikum Instrumentelle Bioanalytik Verdunsten der Lösungsmittelmolekülee kommt es zur Kokristallisation von Matrix und Probenmoleküle, d.h. die Analytmoleküle werden in das Kristallgitter der Matrixmoleküle eingebaut. Im Hochvakuum wird die präparierte Probe mit einem gepulsten UV-Laser beschossen. Als Laser werden meist Stickstofflaser ( = 337 nm) n mit einer Impulsdauer von 3-5 ns oder Nd-YAG-Laser ( = 355 nm) mit einer Impulsdauer von 5-15 nss eingesetzt. Durch den Beschuss verdampfen und ionisieren die Probenmolekülee mit Hilfe der im Überschuss vorhandenen Matrix. Die verwendeten Matrices sind meist kleine organische Moleküle, die beii der eingestrahlten Wellenlänge einen Großteil der zugeführten Energiee absorbieren. Die Matrix, in die die Probe eingebettet ist, hat mehrere Aufgaben. Da sie die Energie aus dem Laserpuls absorbiert, wird die Probe vor photolytischer Zersetzung geschützt. Des Weiteren dient die Matrix der Übertragung der zur Desorption notwendigen Energie auf die Probe. Diee für die Ionisierung erforderlichen Protonen werden von der beigefügten Trifluoressigsäure (TFA) zur Verfügung gestellt. [1,4,5] Elektrospray-Ionisierung (ESI) Das Prinzip der ESI-Technik ist in folgender Abbildung dargestellt: Abbildungg 5 Prinzip der ESI [1]

7 Bei dieser Ionisierungsart wird ein Flüssigkeitsstrom durch eine Kapillare, an der ein elektrisches Feld anliegt in das MS geleitet. Die Flüssigkeit bildet hierdurch beim Austreten aus der Kapillare einen Kegel aus, den Taylor-Konus. Je nach Feldrichtung bilden sich negative oder positive Ionen, die sich an der Spitze des Kegels ansammeln und geladene Tröpfchen bilden. Ist das anliegende elektrische Feld ausreichend groß, wird ein anhaltender Flüssigkeitsstrom von wenigen Mikrometern Durchmesser erzeugt. Beim ESI-Prozess entstehen charakteristischerweise mehrfach geladene Ionen, Moleküle kleiner 1000 Da bilden mitunter nur einfach geladene Ionen. Die Elektrospray-Ionisierung zählt wie die Ionisierung mittels MALDI zu den weichen Ionisierungsarten, d.h. auch hier tritt bei der Ionisierung kein Zerfall in Fragmente auf. [1,5] Massenanalysatoren Flugzeit- (TOF-) Analysatoren TOF-Analysatoren (vom engl. time of flight) sind die am häufigsten eingesetzten Massenanalysatoren in der MALDI-MS. Die Bestimmung der Ionenmassen erfolgt über die Messung der Zeit, die die Ionen zum Zurücklegen der Strecke von der Quelle bis zum Detektor benötigen. Schwere Ionen sind langsamer als leichte und treffen daher später am Detektor an. Den erzeugten Ionen wird durch ein elektrisches Feld eine bestimmte kinetische Energie zugeführt, sie werden hierdurch beschleunigt und treten in ein Flugrohr ein. Hierin durchlaufen sie eine feldfreie Driftstrecke und werden aufgetrennt. Diese Auftrennung erfolgt, da Ionen mit unterschiedlichen Masse/Ladungs-Verhältnissen in der Quelle die gleiche kinetische Energie zugeführt wird, sie hierdurch aber auf unterschiedliche Geschwindigkeiten beschleunigt werden. Die kinetische Energie der Ionen beträgt nach Durchlaufen der Beschleunigungsspannung U: E kin 1 m v 2 2 m z U Hierin ist: m = Masse des Ions v = die Geschwindigkeit des Ions nach der Beschleunigungsstrecke z = Ladungszahl e = Elementarladung Aus der Gesamtflugzeit t und der Länge der feldfreien Driftstrecke des Flugrohres lässt sich die Geschwindigkeit v Berechnen, gemäß:

8 Praktikum Instrumentelle Bioanalytik v L t Einsetzen in obige Gleichung und Umstellung nach m/z liefert: m z 2 e U 2 L t 2 Das Masse/Ladungsverhältniss ist in einem TOF-MS dem Quadrat der Flugzeit proportional, daher lässt sich aus der gemessenen Flugzeit die jeweilige Masse ermitteln. [1,4,5] Es gibt zwei unterschiedliche Arten von Flugrohren [vgl. Abbildung 6]: Abbildung 6 Prinzip eines linearen TOF-MS und einess Reflektor-TOF-MS [1] Bei einem linearenn Flugrohr befindet sich der Detektor am Ende des Flugrohres. Mit dieser Methode lassen die Massen großer Moleküle gut bestimmen, allerdings ist Auflösung in

9 Praktikum Instrumentelle Bioanalytik diesem Modus nicht optimal. Die schlechte Auflösung kommt dadurch d zustande, dass Ionen gleicher Massen mit einer gewissen Verteilungsbreite der Energie starten. Bei einem Reflektor-Flugrohrr wird die Auflösung der Peaks wesentlich w verbessert, da der Unterschied in der zugeführten Energiee gleich schwerer Teilchen durchh den Einbau eines Reflektors kompensiert wird. In einem elektrischen Gegenfeldd wird die Richtung der Ionen umgekehrt. Ionen mit gleicher Masse und höherer Geschwindigkeit dringen weiter in das Gegenfeld ein, legen einen weiteren Weg im Reflektor zurück und holen die langsameren Ionen auf dem Weg zum Detektor wiederr ein. Bei richtiger Einstellung befindet sich an dieser Stelle der Detektor, beide Ionen werden gleichzeitig erfasst, was in einer besseren Auflösung resultiert. [1,5] TOF/TOF-MS TOF/TOF-Instrumente besitzen zwei hintereinande gekoppelte Massenanalysatoren. Der erste TOF-Analysator dient der Selektionn der Ionenn mit einem bestimmtenn Masse/ Ladungs- verhältnis. Dem zweiten Analysator lässt sich eine Kollisionszelle vorschalten, in der die betreffenden Ionenn mit einem Kollisionsgas zusammenstoßenn und infolgedessen fragmen-f tiert werden. Durch diese Fragmentierung wird oftmals eine Strukturaufklärung ermöglicht. [6] 1.3 Proteinidentifikation In nachfolgender dargestellt: Abbildung 7 sind einige gängige Methoden zur Proteinidentifikation Abbildung 7: Gängige Methoden zur Proteinidentifizierung [7]

10 Proteingemische werden beispielsweise durch 1D- oder 2D-Gelelektrophorese aufgetrennt. Durch Färbung sichtbar gemachte Proteinbanden bzw. Spots werden aus dem Gel ausgeschnitten und durch enzymatischen Verdau in Peptide zerlegt. Eines der meist verwendeten Enzyme ist Trypsin, eine Serinprotease, deren katalytischer Mechanismus auf einem reaktiven Serinrest beruht. Trypsin katalysiert die Hydrolyse nach den Aminosäuren Arginin und Lysin Peptide mass fingerprint Das beim tryptischen Verdau entstehende Peptidgemisch ist charakteristisch für das jeweilige Protein (peptide mass fingerprint). Im Internet kann über verschiedene Suchmasken (Profound, Mascot), anhand der gemessenen Peptidmassen, das zugehörige Protein ermittelt werden. Hierfür stehen mehrere Datenbanken wie SwissProt, MSDB oder NCBI zur Verfügung. [7]

11 Praktikum Instrumentelle Bioanalytik 2. Material und Methoden 2.1 Methoden Durchführung der SDS-PAGE Lösung Probenpuffer (2x konz.) Laufpuffer (10x konz.) Tabelle 1 Puffer für SDS-Page Zusammensetzung 16 % (v/v) Tris, ph 6,8 4% (v/v) 2-Mercaptoethanol 23% (v/v) Glycerin 4% (w/v) SDS 0,08% (w/v) Bromphenolblau 240 mm Tris Base 1,9 M Glycin 1% SDS Herstellung 1,6 ml 1MM Tris ph 6,,8 (1M=1,57g/10ml) ph 6,8 mitt 1 Tr 5M NaOH 0,4 ml 2-Mercaptoethanol 2,3 ml Glycerin 0,4 g SDSS 0,008 g Bromphenolblau auf 10 mll mit Reinstwasser auffüllen Tipp: SDSS in 5,72 ml Seradest lösen und dann den Rest dazugeben!!! 29 g Tris Base B 145 g Glycin 10 g SDS auf 1 L mit Reinstwasser auffüllen Zusammenbau der Gelapparatur und Elektrophorese Die Gelkassette wird aus dem Gelrahmen entnommen in den ElektrodensE stand eingesetzt, so dass die kürzere Gelplatte nach innen zeigt. Auf der gegenüberliegenden Seite wird eine weitere Gelkassette oder einee Blindplatte als Abdeckung eingesetzt. Dieser Aufbauu wird in den Klammerrahmen eingesetzt. Durchh gleichzeitiges Herunterdrücken des Elektroden- Die innere Kammer wird schließlich in den Pufferbehälter eingesetzt [vgl. Abbildung 8]. stands und Umlegen der zwei Hebel nach innen wird die innere Kammer zusammengesetzt. Abbildung 8: Zusammenbau der Apparatur für die ElektrophoreE ese [8]

12 Der Taschenformer wird entfernt, die innere Kammer bis zur unteren Markierung mit Laufpuffer befüllt. Probenvorbereitung Für den Versuch wird die bereitgestellte Proteinlösung (c=1,5 mg/1ml) entsprechend verdünnt (mit 10 mm NH 4 HCO 3 ) um Konzentrationen von 15µg/10µL, 10µg/10µL und 5µg/10µL zu erhalten. Man mischt 10 µl der jeweiligen Verdünnung mit 7 µl Probenpuffer und erhitzt die Proben bei 95 C und 500 rpm fünf Minuten lang im Thermomixer. Diese Lösung wird anschließend in die Geltaschen pipettiert. Durchführung der Elektrophorese Mit Gelloader-Pipettenspitzen werden die Proben in die Taschen aufgetragen. Ebenso werden in eine Tasche 10 µl des Proteinmarkers (M2, Fa. BioRad) pipettiert. Die Reihenfolge der Probenauftragung wird protokolliert. Der Deckel wird auf den Pufferbehälter aufgesetzt und ans Spannungsgerät angeschlossen. Die Elektrophorese wird 45 min. bei 170 V (35 ma Begrenzung) durchgeführt und gestoppt wenn die Bromphenolblau-Bande am unteren Gelrand (schwarze Linie) angelangt ist. Färben und Entfärben des Gels Lösung Zusammensetzung Herstellung Färbelösung 50 % (v/v) Methanol 7,5% (v/v) Essigsäure 125 ml Methanol 18,5 ml Essigsäure 0,16% (w/v) Coomassie-Blue 0,4 g Coomassie-Blue G250 G250 auf 250 ml mit Reinstwasser auffüllen Entfärbelösung 30% (v/v) Methanol 7,5% (v/v) Essigsäure Tabelle 2 Färbe- und Entfärbelösung 150 ml Methanol 37,5 ml Essigsäure auf 500 ml mit Reinstwasser auffüllen Nach abgeschlossenem Gellauf wird das Gel aus der Gelkassette entnommen, in die Färbelösung überführt und unter leichtem Schwenken 5 Minuten gefärbt. Anschließend gießt man die Färbelösung ab und gibt die Entfärbelösung zu. Das Gel wird drei Mal für je 20 min., in jeweils frischer Entfärbelösung geschwenkt. Anschließend kann das Gel in Reinstwasser bei 4 C aufbewahrt werden.

13 2.2.2 Tryptischer Verdau Lösung Herstellung 10 mm NH 4 HCO 3 77 mg/ 100 ml Reinstwasser 10 mm DTT 15,4 mg/ 10 ml Reinstwasser 55 mm IAA (immer frisch ansetzen) 10,2 mg/ 1 ml Reinstwasser ACN/ 10 mm NH 4 HCO 3 (50:50) 5 ml ACN/ 5 ml 10 mm NH 4 HCO 3 Tabelle 3 Lösungen für tryptischen Verdau Protokoll in-gel Verdau Alle Gefäße sollten vor Gebrauch mit Wasser und Aceton ausgespült (Keratin!!!) und mit Stickstoff getrocknet werden. Volumen der benötigten Lösungen immer an Gelmenge im Eppi anpassen 1. Gelstücke werden in Würfel (ca. 1 mm Kantenlänge) geschnitten min mit µl H 2 O dd waschen (im Thermomixer) min mit µl 10 mm Ammoniumhydrogencarbonat waschen min mit µl ACN/ 10 mm NH 4 HCO 3 (50:50) entfärben min mit µL 10 mm DTT / 10 mm NH 4 HCO 3 (50:50) bei 60 reduzieren min bei RT mit µL 55 mm Jodacetamid inukbieren (dunkel) 7. waschen/entfärben: je 3x im Wechsel 10 min mit µl 10 mm NH 4 HCO 3 und µl 10 mm NH 4 HCO 3 / ACN (50:50) 8. Gelstücke min im SpeedVac bei 45 C trocknen (Gelstücke müssen weiß sein) µl Trypsinlösung (Stock 100 ng/µl in 1 mm AcOH, Arbeitslösung: Stock 1:3 mit 10 mm Ammoniumhydrogencarbonat verdünnen) zugeben. Nachdem die Trypsinlösung ins Gel Eingesogen ist mit 10-30µL NH 4 HCO 3 -Puffer die Gelstückchen überschichten und über Nacht im Thermomixer bei 500 RPM bei Raumtemperatur verdauen. Die Eppi s vorher mit Parafilm versiegeln. 10. Am nächsten Tag Proben 10 min ins Ultraschallbad stellen zur Freisetzung der Peptide

14 2.2.3 Aufnehmen und Auswertung eines MALDI-TOF/MS-Spektrums Spotten der Probe Die Peptidlösung wird 1:1 mit MALDI-Matrix (10 mg/ml -cyano-4-hydroxyzimtsäure in ACN/H 2 O mit 0,1% TFA) vermischt und auf das MALDI-Target gespottet. Pro Spot werden 0,5 µl aufgetragen. Die notwendige Kalibration führt man mit einem Kalibrationsmix ( Calmix ) durch, der Massen von 900 bis 3660 Da enthält. Der Calmixspot sollte direkt neben dem Probenspot oder zentral in einem Gebiet von bis zu zwölf Spots liegen. Die Spots werden an der Luft getrocknet und der Probenträger ins MS eingebracht. (Dried- Droplet-Methode) Aufnahme der Spektren Vor der Aufnahme des Spektrums lädt man im 4800 Explorer die verwendete Methode (z.b. Reflektormodus oder Linearmodus, positiver oder negativer Modus). Im Massenbereich bis etwa 4000 Da ist der Reflektormodus die Methode der Wahl, bei höheren Massen wird der Linearmodus benutzt. Zu den Parameter, die eingestellt werden müssen, zählen vor allem die Laserintensität, der zu untersuchende Massenbereich (i.d.r. m/z= ) und die verwendete Matrix ( -cyano-4-hydroxyzimtsäure). Bei welcher Laserintensität das Spektrum aufgenommen wird muss im Einzelfall getestet werden, in den meisten Fällen wird die Intensität auf eingestellt. Die Abtastung des Spots durch den Laser wird bei einheitlichem Kristallbild automatisch kontrolliert (Aquisition Control automatic). Bei ungleichmäßigem Kristallbild kann auch eine manuelle Steuerung des Lasers erfolgen. Aufgenommene Spektren werden abgespeichert und können im Data Explorer kalibriert und bearbeitet werden. Kalibration Im Data Explorer öffnet man das Spektrum des Calmixspots und führt eine manuelle Kalibration durch. ( process mass calibration manual calibration ). Hierbei öffnet sich das Kalibrationsfenster im Vordergrund des Spektrums. Bevor die Kalibration gestartet wird, muss eine Referenzdatei angegeben werden, in denen die monoisotopischen Kalibrationsmassen aufgeführt sind. Man zieht nun mit gehaltener rechter Maustaste ein Rechteck über einen monoisotopischen (Kalibrations-)Peak auf und lässt die Maustaste los. Es öffnet sich ein Fenster ( select or create reference...), wo die Masse des gewählten Peaks mit der Kalibrationsdatei verglichen wird. Ist als type resolved zu sehen, mit ok bestätigen. Dieses Vorgehen mit allen Kalibrationspeaks wiederholen. Die Kalibration wird mit Plot und Apply calibration abgeschlossen.

15 Zur Kalibration der Probenspektren öffnet man diese und wählt über process mass calibration import calibration die zuvor erstellte Kalibationsdatei (*.cal) aus. Ein kalibriertes Spektrum erkennt man an dem MC in der Überschrift. Die Datenbankrecherche Mit dem Makro Get Peak List wird eine Liste der monoisotopischen Peptidmassen des kalibrierten Spektrums erstellt und im Result Window ausgegeben. Diese Liste wird mit Strga und Strg-c in die Zwischenablage kopiert. Im Internet wird die Suchmaske Mascot geöffnet ( In der Suchmaske werden folgende Eingaben gemacht: Database NCBInr Enzyme Trypsin Allow up to 1 missed cleavages Taxonomy all entries Fixed modifications Carbamidomethyl (C) Variable modifications --- none selected --- Protein mass -leer- Peptide tol Mass values MH+ Monoisotopic yes Query Peakliste aus der Zwischenablage einfügen Die Suche wird mit Start Search gestartet.

16 3. Literaturverzeichnis [1] Lottspeich F., Zorbas H. (Hrsg.), Bioanalytik, Spektrum, Heidelberg 1998 [2] Richter G., Praktische Biochemie, Thieme, Stuttgart 2003 [3] Stryer L., Berg. J., Tymoczko J., Biochemie, Spektrum, 5. Auflage, Heidelberg 2003 [4] Budzikiewicz H., Massenspektrometrie, WILEY-VCH, Weinheim 1998 [5] Lehmann W., Massenspektrometrie in der Biochemie, Spektrum, Heidelberg 1996 [6] [ ] [7] Thiede B. et al., Methods, 2005 (Artikel im Druck) [8] Küster B. et al, Analytical Biochemistry 250 (1997), , Article No. AB Was Sie wissen sollten: Prinzip der SDS-PAGE Gelelektrophorese, isoelektrische Fokussierung, Prinzip 2D-Gelelektrophorese, Aufbau und Funktionsweise eines Massenspektrometers, MALDI-TOF, Bioinformatik, Proteinmodifikationen