IVD Bacterial Test Standard
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- Otto Schulze
- vor 8 Jahren
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1 Gebrauchsanweisung IVD Bacterial Test Standard Standard für die Massenkalibrierung mit einem für Escherichia coli DH5 alpha charakteristischen Peptid-/Protein-Profil sowie zusätzlichen Proteinen. Zur Verwendung in der Matrix-unterstützten Laser-Desorption/Ionisation Time-of-Flight Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS). CARE- Produkte unterstützen unsere Kunden weltweit mit hochwertigen Verbrauchsartikeln, Zubehör und Spezial-Kits. Die Produkte aus der CARE- Familie sind für Systeme von Bruker Daltonics optimiert und zertifiziert. Sprache: de Revision 4 (Januar 2014)
2 1 Verwendungszweck 2 2 Produktbeschreibung 2 3 Überprüfung, Aufbewahrung und Stabilität Überprüfung nach Eingang Aufbewahrung nach Eingang Aufbewahrung nach Aliquotierung 3 4 Risiko- und Sicherheitshinweise 3 5 Softwareanforderungen 4 6 IVD BTS Probenpräparation Anlösen und Aliquotieren von IVD BTS Präparation einer IVD BTS-Probe auf einer MALDI-Targetplatte 5 7 Kalibrierung des MALDI-TOF-Massenspektrometers mithilfe von IVD BTS Verwendete Kalibrierpunkte Kalibrierverfahren Manuelles Kalibrierverfahren Automatisches Kalibrierverfahren 9 8 Hersteller 12 1 Verwendungszweck Der IVD Bacterial Test Standard ist ein Produkt für die In-vitro-Diagnostik und wird für die Kalibrierung und Optimierung massenspektrometrischer Messungen sowie zur Leistungskontrolle für die Identifikation der aus menschlichen Proben kultivierten Mikroorganismen verwendet. 2 Produktbeschreibung Der IVD Bacterial Test Standard (bezeichnet als IVD BTS ) enthält einen sorgfältig präparierten Extrakt des Escherichia coli - Stamms DH5 alpha. Dieser weist in MALDI- TOF MS-Spektren charakteristische Peptid- und Proteinprofile auf. Der Extrakt ist mit zwei zusätzlichen Proteinen versetzt, um die obere Grenze des vom IVD BTS abgedeckten Massenbereichs zu erhöhen. Der IVD BTS deckt einen Massenbereich zwischen 3,6 und 17 kda ab. Jedes Röhrchen enthält Material für die Präparation von ca. 40 Spots auf einer MALDI-Targetplatte. Dieses Kit ist für in-vitro-diagnostische Zwecke zu verwenden. Bestellinformationen Produkt Bestellnummer IVD Bacterial Test Standard, 5 Röhrchen oder Seite 2 von 12 IVD Bacterial Test Standard Gebrauchsanweisung Revision 4
3 3 Überprüfung, Aufbewahrung und Stabilität 3.1 Überprüfung nach Eingang Die Verpackung des IVD BTS ist nach dem Eingang zu überprüfen. Bei beschädigter Verpackung sind die Probenröhrchen zu überprüfen. Wenn auch die Probenröhrchen beschädigt sind, darf der IVD BTS nicht verwendet werden. Der IVD BTS (Probenröhrchen und Verpackung) ist gemäß den im Datenblatt zur Materialsicherheit angegebenen Richtlinien zu entsorgen und die Service-Abteilung von Bruker Daltonik GmbH ist zu kontaktieren um Ersatz anzufordern. 3.2 Aufbewahrung nach Eingang 18 C Der Versand des IVD BTS erfolgt bei Umgebungstemperatur. Der IVD BTS muss unmittelbar nach dem Eingang bei 18 C oder tiefer aufbewahrt werden. Das auf der Verpackung angegebene Verfallsdatum gilt nur, wenn der IVD BTS direkt nach dem Eingang bei 18 C oder tiefer eingefroren wird. 3.3 Aufbewahrung nach Aliquotierung Der IVD BTS muss vor der Verwendung aufgelöst werden. Wir empfehlen dringend, aufgelösten IVD BTS zu aliquotieren und in einem 0,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss einzufrieren. 18 C Der eingefrorene, aufgelöste IVD BTS ist bei 18 C oder tiefer bis zu 5 Monate lagerfähig. Im Laufe der Zeit können Oxidationsprodukte entstehen. Diese Oxidationsprodukte haben keinen nennenswerten Einfluss auf die Spektrenqualität. 4 Risiko- und Sicherheitshinweise Dieses Produkt ist nicht nach Verordnung (EG) Nr. 1272/2008 klassifiziert. Damit besteht auch keine Klassifizierung nach dem global harmonisierten System zur Einstufung und Kennzeichnung von Chemikalien (GHS). Nach Kenntnis des Herstellers ergeben sich bei ordnungsgemäßer Verwendung des Produkts keine schädlichen Effekte. Allerdings besteht bei allen Materialien die Möglichkeit, dass unter Umständen bisher unbekannte Gefährdungen auftreten. Für weitere Informationen ist das Datenblatt zur Materialsicherheit durchzulesen, welches unter zum Download zur Verfügung steht. Zur Durchführung der in dieser Gebrauchsanweisung beschriebenen Verfahren werden möglicherweise zusätzliche Chemikalien benötigt. Die vom Hersteller zur Verfügung gestellten Datenblätter zur Materialsicherheit sind sorgfältig durchzulesen. Beim Umgang mit Chemikalien und biologisch gefährlichem Material sind die allgemein gültigen Sicherheitsbestimmungen einzuhalten. Revision 4 IVD Bacterial Test Standard Gebrauchsanweisung Seite 3 von 12
4 5 Softwareanforderungen Bestimmte Softwareversionen/- kombinationen müssen mit einem kostenlosen Softwarepatch aktualisiert werden, um IVD BTS zu unterstützen (siehe Tabelle 1). Hinweise zur Installation erteilt das örtliche Service Team von Bruker Daltonics. Tabelle 1 Anforderungen an Softwarepatch Softwareversion Compass- Version Softwarepatch erforderlich? flexcontrol-version Nein Nein Ja Ja Ja Ja Ja Ja 6 IVD BTS Probenpräparation Hinweis Das nachfolgende Verfahren sollte nicht angewandt werden, wenn der Workflow vorgeschriebene Präparationsmethoden für den IVD BTS enthält (z.b. IVD MALDI Biotyper SOPs). Vorbemerkungen Eine unzureichende Probenpräparation vermindert die Sensitivität und ergibt eine geringe Auflösung und schlechte Reproduzierbarkeit. Die Erzeugung von Ionen mit dem MALDI-Verfahren gelingt nur dann, wenn ein optimales Matrix/Analyt-Mischverhältnis vorliegt. Die besten Ergebnisse werden mit frisch präparierten Lösungen und hochreinen Chemikalien erzielt (z.b. CHROMASOLV LC- MS- Lösungsmittel). Benötigte Chemikalien und Materialien IVD Matrix HCCA-portioned (bezeichnet als IVD HCCA") (Best.-Nr oder ) oder Matrix HCCA-portioned (bezeichnet als HCCA", HCCA = α-cyano-4-hydroxy-zimtsäure) (Best.-Nr oder ), die entsprechend der maßgeblichen Gebrauchsanweisung präpariert werden muss. Standardlösungsmittel (50% Acetonitril, 47,5% Wasser, 2,5% Trifluoressigsäure) von Sigma- Aldrich (Best.-Nr ), welches von Bruker Daltonik GmbH getestet wurde und zum Anlösen des IVD BTS empfohlen wird. Mikrozentrifugenröhrchen (Sarstedt, Best.-Nr ) mit Schraubverschluss (Sarstedt, Best.-Nr ). MALDI-Target des für den Workflow ausgewählten Typs. Erforderliche Ausstattung Zentrifuge, Schüttler, Pipetten, Pipettenspitzen Seite 4 von 12 IVD Bacterial Test Standard Gebrauchsanweisung Revision 4
5 6.1 Anlösen und Aliquotieren von IVD BTS µl Standardlösungsmittel zu dem IVD BTS- Pellet geben und durch mindestens 20-faches Auf- und Abpipettieren bei Raumtemperatur auflösen. Ein Aufschäumen der Lösung ist zu vermeiden! 2. Die IVD BTS-Lösung 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und danach durch mindestens 20- faches Auf- und Abpipettieren vermischen Minuten lang mit U/min bei Raumtemperatur zentrifugieren. 4. Vom Überstand 5-µL-Aliquote in Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss pipettieren und diese danach fest verschließen. 5. Die Aliquote bei 18 C oder tiefer aufbewahren. 6.2 Präparation einer IVD BTS-Probe auf einer MALDI- Targetplatte Hinweis Gefrorene IVD BTS-Aliquote sollten bei Raumtemperatur aufgetaut und durch Antippen des Mikrozentrifugenröhrchens mit dem Finger vermischt werden. Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss sollten sofort nach der Präparation von IVD BTS- Probenspots verschlossen und bei 18 C oder tiefer aufbewahrt werden. Jedes 5- µl-aliquot enthält Material für mindestens vier Probenspots µl der IVD BTS- Lösung auf einer beliebigen Position der MALDI- Targetplatte präparieren. 2. Den IVD BTS-Probenspot bei Raumtemperatur trocknen. 3. Den IVD BTS- Probenspot nach dem Trocknen sofort mit 1 µl IVD HCCA- oder HCCA- Matrixlösung überschichten. 4. Den Probenspot bei Raumtemperatur trocknen. Auf eine homogene Präparation sollte geachtet werden. 7 Kalibrierung des MALDI-TOF- Massenspektrometers mithilfe von IVD BTS 7.1 Verwendete Kalibrierpunkte Tabelle 2 Kalibrierpunkte mit einer Massentoleranzgrenze von ±300 ppm Protein Referenzmasse (mittlere Masse) Toleranzbereich ±300 ppm RL29 [M+2H] ,8 Da 3636,7 Da 3638,8 Da RS32 [M+H] ,8 Da 5095,3 Da 5098,3 Da RS34 [M+H] ,4 Da 5379,8 Da 5383,0 Da Revision 4 IVD Bacterial Test Standard Gebrauchsanweisung Seite 5 von 12
6 Protein Referenzmasse (mittlere Masse) Toleranzbereich ±300 ppm RS33meth [M+H] ,4 Da 6253,5 Da 6257,3 Da RL29 [M+H] ,5 Da 7272,3 Da 7276,7 Da RS19 [M+H] ,1 Da 10297,0 Da 10303,2 Da RNAse A [M+H] ,2 Da 13679,1 Da 13687,3 Da Myoglobin [M+H] ,3 Da 16947,2 Da 16957,4 Da 7.2 Kalibrierverfahren Ein manuelles und ein automatisches Kalibrierverfahren stehen zur Verfügung. Das manuelle Kalibrierverfahren kann mit allen flexcontrol- Versionen durchgeführt werden, während für die automatische Kalibrierung flexcontrol Version 3.3 oder höher erforderlich ist Manuelles Kalibrierverfahren 1. Das mit der IVD BTS-Probe präparierte MALDI-Target in das MALDI-TOF-Massenspektrometer einführen. 2. Sicherstellen, dass flexcontrol gestartet wurde. 3. Für die Messung und die Kalibrierung die flexcontrol-standardmethode MBT_FC.par (positiver Linearmodus) verwenden. 4. Manuell ein Summenspektrum erstellen. Dazu den IVD BTS- Spot auf unterschiedlichen Rasterpositionen in 6 Serien je 40 Shots mit dem Laser beschießen. Dazu an der gewünschten Rasterposition auf die Schaltflächen Start und Add klicken und insgesamt 240 Laserschüsse aufsummieren (werden wie folgt angezeigt: Laserenergie sollte optimiert werden. Optional: ). Die Alternativ zur manuellen Aufnahme eines Summenspektrums kann ein Summenspektrum auch wie folgt automatisiert generiert werden : Auf die Registerkarte AutoXecute klicken. Die autox- Methode MBT_ AutoX in der Dropdown- Liste Method auswählen (Abbildung 1). Auf die Schaltfläche Run method on current spot klicken. Abbildung 1 Registerkarte AutoXecute mit Auswahl der Methode MBT_AutoX für die automatische Messung des Summenspektrums Das Summenspektrum wird automatisch gemessen. 5. In der Symbolleiste auf die Symbolschaltfläche Single Buffer klicken, um das aktuell angezeigte Einzelspektrum auszublenden. Die Symbolschaltfläche Sum Buffer Seite 6 von 12 IVD Bacterial Test Standard Gebrauchsanweisung Revision 4
7 wird aktiviert und das gemessene Summenspektrum angezeigt. 6. In der Symbolleiste auf die Symbolschaltfläche Smooth Spectrum klicken, um das Summenspektrum zu glätten (Abbildung 2). Abbildung 2 Geglättetes Summenspektrum für IVD BTS 7. Auf die Registerkarte Calibration klicken und die Kalibrierdatei MBT_ Standard in der Dropdown-Liste Mass Control List auswählen (Abbildung 3). Abbildung 3 Registerkarte Calibration mit Mass Control List 8. Auf die Schaltfläche Automatic Assign klicken, um die Kalibrierpeaks automatisch zu erfassen. Revision 4 IVD Bacterial Test Standard Gebrauchsanweisung Seite 7 von 12
8 9. Prüfen, ob die automatische Zuordnung der Kalibrierpeaks richtig durchgeführt wurde. In der Kalibrierpeakliste sollten alle Kalibrierpeaks erfasst worden sein und außerdem sollte die maximale Abweichung Err/ppm für jeden Peak innerhalb von ±300 ppm liegen (Abbildung 4). Abbildung 4 Ergebnis der automatischen Erfassung der Kalibrierpeaks, wenn alle Peaks zugeordnet wurden und die maximale Abweichung Err/ppm für alle Peaks unter ±300 ppm liegt Je nach Ergebnis wie folgt fortfahren: Wenn alle Peaks zugeordnet wurden und die maximale Abweichung Err/ppm für alle Peaks unter ±300 ppm liegt, war die automatische Zuordnung der Kalibrierpeaks erfolgreich. Mit Schritt (12) fortfahren. Wenn alle Peaks zugeordnet wurden, die maximale Abweichung Err/ppm für einen der Peaks jedoch über ±300 ppm liegt, die Schritte (4) bis (9) wiederholen. Wenn nur einige Peaks zugeordnet wurden und die maximale Abweichung Err/ppm für alle Peaks unter ±300 ppm liegt, mit Schritt (10) fortfahren. Wenn nur einige Peaks zugeordnet wurden und die maximale Abweichung Err/ppm für einen der Peaks über ±300 ppm liegt, die Schritte (4) bis (9) wiederholen. Wenn keine Peaks zugeordnet wurden, mit Schritt (11) fortfahren. 10. Auf die Schaltfläche Apply klicken und die automatische Peakzuordnung durch Klicken auf Automatic Assign wiederholen. Prüfen, ob alle Peaks zugeordnet wurden und die maximale Abweichung Err/ppm für alle Peaks unter ±300 ppm liegt. Wenn alle Peaks zugeordnet wurden und die maximale Abweichung Err/ppm für alle Peaks unter ±300 ppm liegt, war die automatische Zuordnung der Kalibrierpeaks erfolgreich. Mit Schritt (12) fortfahren. Wenn nicht alle Peaks zugeordnet wurden oder die maximale Abweichung Err/ppm für einen der Peaks über ±300 ppm liegt, die Schritte (4) bis (9) wiederholen. Seite 8 von 12 IVD Bacterial Test Standard Gebrauchsanweisung Revision 4
9 11. Den Peak bei m/z Da durch Klicken auf die linke Seite des Peaks im Spektrum manuell auswählen. Die Farbe der senkrechten Linie neben dem Peak muss von rot nach grün wechseln, damit die Peakzuordnung einwandfrei erfolgt (die entsprechenden Daten werden in die Liste der Kalibrierpeaks eingetragen). Auf die Schaltfläche Apply klicken und die automatische Peakzuordnung durch Klicken auf Automatic Assign wiederholen. Prüfen, ob alle Peaks zugeordnet wurden und die maximale Abweichung Err/ppm für alle Peaks unter ±300 ppm liegt. Wenn alle Peaks zugeordnet wurden und die maximale Abweichung Err/ppm für alle Peaks unter ±300 ppm liegt, war die automatische Zuordnung der Kalibrierpeaks erfolgreich. Mit Schritt (12) fortfahren. Wenn nicht alle Peaks zugeordnet wurden oder die maximale Abweichung Err/ppm für einen der Peaks über ±300 ppm liegt, die Schritte (4) bis (9) wiederholen. 12. Nachdem alle Peaks automatisch zugeordnet wurden (maximale Abweichung Err/ppm für alle Peaks unter ±300 ppm), auf die Schaltfläche Apply klicken. 13. Die neuen Kalibrierwerte in der flexcontrol-methode (MBT_FC.par) speichern. Durch Klicken auf die Symbolschaltfläche Save method as in der Symbolleiste wird der Dialog Save flexcontrol Method As geöffnet. Auf die Schaltfläche Save klicken. Das Ersetzen der Datei (MBT_FC.par) durch Klicken auf Yes im Bestätigungsdialog bestätigen (Abbildung 5). Abbildung 5 Bestätigungsdialog beim Ersetzen der angegebenen Methodendatei Automatisches Kalibrierverfahren Hinweis Für die automatische Kalibrierung ist flexcontrol Version 3.3 oder höher erforderlich. 1. Das mit der IVD BTS-Probe präparierte MALDI-Target in das MALDI-TOF-Massenspektrometer einführen. 2. Sicherstellen, dass flexcontrol gestartet wurde. 3. Für die Messung und die Kalibrierung die flexcontrol-standardmethode MBT_FC.par (positiver Linearmodus) verwenden. Revision 4 IVD Bacterial Test Standard Gebrauchsanweisung Seite 9 von 12
10 4. Tools > Method Calibration Parameters auswählen ( Abbildung 6 ), um die Kalibriereinstellungen der flexcontrol-methode festzulegen oder zu überprüfen. Hinweis Die Festlegung der Kalibrierparameter ist nur für die erste (initiale) Kalibrierung erforderlich. Bei nachfolgenden Kalibrierungen muss nur die initiale Auswahl der richtigen autox-methode (MBT_AutoX) überprüft werden. Abbildung 6 Befehl Method Calibration Parameters im Menü Tools 5. Die Einstellungen für die Parameter der automatischen Kalibrierung (siehe Abbildung 7) eingeben oder überprüfen. Anschließend auf OK klicken. Abbildung 7 Dialog Edit Auto Calibration Parameters Seite 10 von 12 IVD Bacterial Test Standard Gebrauchsanweisung Revision 4
11 6. Auf der Registerkarte Calibration (Abbildung 3) überprüfen, ob der Parameter Peak Assignment Tolerance auf den Höchstwert von ppm eingestellt ist (Abbildung 8). Abbildung 8 Dialog Peak Assignment Tolerance 7. Zum Starten der Kalibrierung auf die Schaltfläche Calibrate klicken. Es wird automatisch ein Summenspektrum erstellt. Dazu wird der IVD BTS- Spot auf unterschiedlichen Positionen in 6 Serien je 40 Shots mit dem Laser beschossen. Die Durchführung der Kalibrierung erfolgt automatisch. Nach erfolgreicher Kalibrierung wird ein Informationsdialog (Abbildung 9) angezeigt. Auf OK klicken, um die Kalibrierung abzuschließen. Abbildung 9 Informationsdialog zur Kalibrierung 8. Wenn die Kalibrierung fehlgeschlagen ist, die Schritte (4) bis (7) für die automatische Kalibrierung wiederholen oder die manuelle Kalibrierung wie in Abschnitt beschrieben durchführen. Revision 4 IVD Bacterial Test Standard Gebrauchsanweisung Seite 11 von 12
12 8 Hersteller Bruker Daltonik GmbH Fahrenheitstraße Bremen Deutschland Support biotyper.support@bdal.de Telefon: +49 (421) Fax: +49 (421) Vertriebsinformation care@bdal.de Telefon: +49 (421) Internet: # oder Anstelle der Informationen aus älteren Dokumenten gelten die Beschreibungen und technischen Spezifikationen aus diesem Dokument. Diese können ohne vorherige Benachrichtigung geändert werden. Copyright 2014 Bruker Daltonik GmbH Seite 12 von 12 IVD Bacterial Test Standard Gebrauchsanweisung Revision 4
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