Elektrophorese. Christopher Gerner Universität Wien

Transkript

1 Elektrophorese Christopher Gerner Universität Wien

2 Literatur: Reiner Westermeier: Elektrophorese-Praktikum, Verlag Chemie 1996 verständlich geschrieben, sehr Labor-orientiert, einige Techniken nicht mehr ganz aktuell Current Protocols in Protein Science, Wiley regelmäßiges update, sehr verlässlich, ausführlich beschrieben, optimale Begleitung für jeden der eine neue Technik im Labor etablieren möchte Methods in Enzymology, Academic Press bislang über 400 Bände, sehr ausführlich und mit vielen Spezialanwendungen

3 Grundlagen Klassische Elektrophorese: Zonenelektrophorese (aus: Westermeier

4 Anfänge (1937): Wandernde-Grenzschichten- Elektrophorese Moleküle wandern je nach Ladungszahl und Ladungsart in unterschiedliche Richtungen, mit Hilfe von Lichtbrechung kann man verschiedene Frontenbildungen verfolgen (Schlieren-Optik) (aus: Westermeier)

5 Isotachophorese Moleküle wandern zwischen schnellem Leitelektrolyt (L) und langsamen Folge-elektrolyt (T von terminierend) Dadurch ergibt sich eine Feldinhomogenität, welche einen Stacking-Effekt der Proteine verursacht (siehe Abbildung) (aus: Westermeier)

6 Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) Gelmatrix für Proteingele Acrylamid (giftig! Nervengift) Quervernetzer: Bisacrylamid oder Piperazindiacrylamid (PDA) Polymerisationsinitiator: Ammonium-peroxodisulfat Polymerisationskatalysator: Tetramethylethylendiamin (TEMED)

7 Diskontinuierliche Elektrophorese Zwei Gelsysteme: 1. Trenn-Gel: 8-15% aa, Tris/HCl ph Sammel-Gel: 4% aa, Tris/HCl ph 6.8 Zuerst Isotachophorese: Stapel an Proteinen in Reihenfolge ihrer Mobilität nur von Ladung, nicht von Größe abhängig ( Stacking ) Dann: Proteine treffen auf dichtes Gel, Reibungswiderstand Stau und Zonenschärfung. Glycin überholt Proteine jetzt: Zonenelektrophorese Mobilität jetzt von Ladung und Molekülgröße abhängig (aus: Westermeier)

8 SDS-Elektrophorese Natriumdodecylsulfat (SDS): anionisches Detergenz, effektive Beladung der Proteine mit ca 1,4g SDS pro g Protein. Effiziente Denaturierung und Streckung der Proteine, durch Zugabe von Reduktionsmittel 2-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol Reduktion von Disulfidbrücken und somit vollständige Denaturierung Vorteile: beinahe alle Proteine gehen in Lösung Hohe elektrophoretische Mobilität Alle Proteine wandern in eine Richtung, getrennt wird nur nach einem Parameter, dem Molekulargewicht Durch praktisch vollständige Denaturierung hohes Auflösungsvermögen Merke: ein klassisches SDS-Gel ist eine SDS-Disk-Elektrophorese

9 Isoelektrische Fokussierung (IEF) Prinzip: Protein wandert nur, wenn es geladen ist. Der Ladungszustand hängt vom ph ab. Im Gel liegt ein ph-gradient vor. Jedes Protein wandert bis zur Zone, in dem der ph dem pi des Proteins entspricht, dann bleibt es stehen. Kommt es aus seiner Zone, wird es wieder geladen und wandert zurück (Fokussierung)! (aus: Westermeier)

10 1.) Freie Trägerampholyte Wie kommt ph-gradient zustande? ph-gradient entsteht im elektrischen Feld und wird durch Probe beeinflusst. 2.) Immobilisierte ph-gradienten (IPG): ph-gradient ist in das Gel einpolymerisiert und wird durch Probe nicht beeinflusst bessere Reproduzierbarkeit! (aus: Westermeier)

11 2D-pattern analysis

12 Metabolischer 35 S-Einbau Messung der Proteinsynthese Zellen wachsen unter Aufnahme von 35 S-Methionin und 35 S-Zystein aus dem Medium, Proteine werden dadurch mittels Autoradiographie nachweisbar Silver stain 35 S-Autoradiograph

13 Metabolischer 32 P-Einbau Messung der Protein Phosphorylierung Silver stain 32 P-Autoradiograph

14 Quantitative Analyse durch Bestimmung der intergrierten Spot-Intensitäten 35 S-

15 Kalibrierung der Protein- Synthese 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 composition of a protein spot A B C 35S-labeled unlabeled Frage: Welcher Anteil der Proteinmenge in einem spot wurde während des metabolischen Einbaus neu gebildet?

16 Kalibrierung der Protein- Synthese Sezerniertes Protein kann als rein neu synthetisiertes Protein gewonnen werden Analyse von haptoglobin aus dem Zellüberstand von IL-6 behandelten HepG2 (Hepatokarzinom) Zellen

17 Kalibrierung der Protein- Synthese Summe aus 6 spots von Haptoglobin, das von 3x10 6 Zellen innerhalb einer Stunde gebildet wird: Fluoreszenz-Detektion: 130 ng Autoradiographie: 304,000 arbitrary units

18 Kalibrierung der Protein- Synthese Aminosäure-Sequenz von Haptoglobin enthält 5 Methionine Resultat: 1pMol 35 S = 18,000 +/- 3,200 arbitrary units

19 Herausforderung: Hitzeschock-Experiment: Erhöhung der hsp Proteinsynthese (AR) Erhöhung der hsp Proteinmenge (FL) Kommen diese beiden unabhängigen Bestimmungen zum selben Resultat?

20 Zelluläre Reaktionen auf Hitzeschock U937 Zellen, 7min 44 C, 4h chase, 35 S-Autoradiographie

21 Hitzeschock-Experiment: Design

22 Erhöhung der hsp70 Menge

23 Erhöhung der hsp70 Synthese

24 Integration der hsp70 Synthese ergiebt die Gesamt-Proteinmenge

25 Implikation: In Kenntnis der Protein-Menge und Syntheserate wie lange dauert es, um die in Zellen vorhandene Proteinmenge zu bilden? Maß für Protein Umsatz

26 Berechnung von Protein-Umsatz I Protein-amount versus synthesis: t 1/2 = (A total /2) / ((SR * t dupl A total )/ t dupl ) t 1/2 : biological half-life A total : absolute protein amount SR: synthesis rates of respective protein t dupl : duplication time of cells (29.5 h in the presented experiment)

27 Berechnung von Protein-Umsatz II pulse-chase experiment: t 1/2 = - 24 * log2/log(art 24 /ARt 0 ) ARt 0 : autoradiograph intensity of a protein after pulsing the cells ARt 24 : autoradiograph intensity of a protein after pulsing and subsequently chasing the cells for 24 hours.

28 Auswertung der Daten

29 Quantitative Proteom-Profile Absolute Protein Mengen Absolute Synthese-Raten Phosphorylierungs-Zustand Umsatzraten Subzelluläre Lokalisierung

30 Proteinidentifikationsverfahren Edman-Abbau, Spaltung einzelner N-terminaler Aminosäuren und danach Identifikation mit HPLC, nicht mehr geläufig Western-Blot: Übertragung der Proteine auf Membran (Nitrozellulose, PVDF) Dort Erkennung mittel Antikörper gekoppelt an spezifischer Färbereaktion (heute zumeist: Lichtfreisetzung) Massenspektrometrie: einzelne spots werden ausgestanzt, mittels Trypsin verdaut und die Peptide mittels Fragmentierungsanalyse im Massenspektrometer sequenziert

31 Gelfixierung Um Proteine am Ausbluten zu verhindern, werden die Proteine mit Essigsäure/Ethanol (auch Methanol) denaturiert und dadurch im Gel fixiert. Notwendig für alle Färbeverfahren und vor MS-Analysen, nicht durchgeführt vor dem Blotten

32 Detektionsverfahren Coomassie Brilliant Blue: Gel in Farblösung gefärbt, danach Hintergrund entfärbt. Quantitativ, mäßig empfindlich, einfach, billig, MS-kompatibel, dauert relativ lang Silberfärbung: Gel wird mit Silberkomplex behandelt und danach entwickelt nicht quantitativ, sehr empfindlich, einfach, billig, MS-kompatibe, rasch Fluoreszenzfärbung: Gel wird mit Fluoreszenzfarbstoff gefärbt, danach Hintergrund entfärbt. Quantitativ, sehr empfindlich, einfach, billig bis sehr teuer, MS-kompatibel, Geräte-technisch aufwändig Protein labeling dyes: Farbstoff kovalent an Protein gebunden, maximale Empfindlichkeit, quantitativ, rasch, zumeist sehr teuer

33 FluoImaging: Financial Aspects ruby TM protein stain: ca 40 per gel RuBPS stain: ca 1,2 cent per gel 40µg jurkat cytosol

34 Kopplungsverfahren Kopplung von Trennverfahren mit Detektionsverfahren bzw. Identifikationsverfahren sehr sinnvoll, oft sogar notwendig. Kopplung bedeutet zumeist direkte mechanische Verbindung und automatiserte Analyseverfahren Typisch: LC-MS, GC-MS, LC-Atomemissionsspektrometrie Vorteile: hohe Informationsdichte, hohe Automatisierbarkeit, optimale Prozeßkontrolle

35 Analyse von biologischen Prozessen: zb Programmierter Zelltod Elektronen-Mikroskopie Verarmung des Zytoplasmas an Organellen, Kondensation des Chromatins Jurkat control Jurkat anti-fas treated

36 Proteolytische Aktvität der Protease Caspase-3

37 Protein Translokation während der Apoptosis

38 Bsp. Affinitätschromatographie-2D-PAGE Plasma depletions-säule: Abundante Proteine (hier: Albumin, Serotransferrin, Haptoglobin, Antitrypsin, Ig-A, Ig-G) werden durch Antikörper in der Säule gebunden, andere fließen ungehindert durch. Gebundene Proteine werden in zweitem Schritt eluiert. Dadurch relative Anreicherung der gering konzentrierten Proteine Plasma control bound to column flow through