2 Praxis Photometrische Eigenschaften von Bacteriorhodopsin und Rekonstitution des Membranproteins in Liposomen

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1 2 Praxis Photometrische Eigenschaften von Bacteriorhodopsin und Rekonstitution des Membranproteins in Liposomen Die Versuche zum integralen Membranprotein Bacteriorhodopsin (BR) unterteilen sich in drei Bereiche: 1. Rekonstitution von BR aus Purpurmembran (PM) in Asolectin-Liposomen. Das Überführen des Membranproteins in eine Lipiddoppelschicht geschieht dabei auf zwei Arten, zum einen über die Freeze-Thaw-Methode und zum anderen über das Solubilisieren und anschließende Entfernen des Detergens in Anwesenheit des Asolectins. Um die entsprechenden Rekonstitutionsansätze auszurechnen, muss die Konzentration an BR vorher mit Hilfe von Absorptionsspektren bestimmt werden. (siehe Kapitel 2.1). Die in diesem Versuchteil hergestellten BR-Liposomen werden ebenfalls für den Versuch 5 Praxis Zentrifugationstechniken zur Reinigung von Purpurmembranen und Kontrolle der Bakteriorhodopsinrekonstitution in Liposomen benötigt. 2. Untersuchung von licht- und dunkeladaptiertem BR mittels Absorptionsphotometrie. 3. Analyse des Photozyklus von BR anhand der Änderung der Absorption bei einer definierten Wellenlänge (568 nm und 412 nm) gegen die Zeit mit Hilfe von Guanidinhydrochlorid. Allgemeine Hinweise: Sofern nicht anders angegeben, werden alle folgenden Arbeitsschritte bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt. BR-Lösungen werden bei 4 C im Kühlschrank unter Lichtausschluss gelagert, indem man entsprechende Behältnisse in Alufolie einpackt. Beim Bearbeiten der Proben stellt Belichtung jedoch kein Problem dar. Da sich die Extinktionskoeffizienten auf belichtetes BR beziehen, müssen die Proben (je nach vorhandenen Lichtverhältnissen) sogar vor der Messung belichtet werden. Für diesen Zweck wird eine Lampe zur Verfügung gestellt. Falls sich die PM während der Lagerung im Kühlschrank absetzen sollte, dann kann man die Lösung durch Resuspendieren wieder in ihren Ausgangszustand versetzen. Die Angabe H 2 O bei den Lösungen im Skript bezieht sich stets auf die Verwendung von vollentsalztem Wasser (VE-Wasser). Wenn nachfolgend von Küvetten gesprochen wird, sind stets PMMA Einweg-Küvetten (optischer Weg d = 10 mm) gemeint mit Ausnahme der Absorptionsspektren von BR, die zur Konzentrationsbestimmung für die Rekonstitutionsansätze verwendet werden. Hier werden Quarzküvetten mit d = 1 mm benutzt, die aufgrund des teuren Preises mit äußerster Sorgfalt zu behandeln sind! 1

2 Zur Untersuchung des Membranproteins werden drei BR-Stammlösungen benötigt: a) BR_Sol solubilisiertes BR für die Rekonstitution über die Entfernung des Detergens (siehe 2.1) b) BR_FT BR in Purpurmembran für die Rekonstitution über Freeze-Thaw (siehe 2.1) c) BR_HD BR in Purpurmembran für die Untersuchung der Hell-Dunkel-Adaption (siehe 2.2) Ausgangslösung sind Isolierungen von PM aus Halobacterium salinarum, die mit entsprechend angegebener Konzentration bei -20 C gelagert und für das Praktikum zur Verfügung gestellt werden. Nach Ansetzen der BR-Lösungen wird die isolierte PM, die nicht weiter verwendet wird, wieder mit Hilfe von flüssigem Stickstoff (-196 C, Schutzbrille! Hier Latex- und Nitrilhandschuhe aus und auch auf benachbarte Studenten achten!) eingefroren und bei -20 C gelagert. Die BR-Proben werden in 150 mm KCl-Lösung angesetzt (wird auch für den Praktikumsteil 5 Praxis Zentrifugationstechniken zur Reinigung von Purpurmembranen und Kontrolle der Bakteriorhodopsinrekonstitution in Liposomen benötigt). 1 L 150 mm KCl-Lösung wird deshalb vor Beginn des Versuches von jeder Gruppe hergestellt. 2.1 Rekonstitution von Membranproteinen Will man die Struktur und Funktion eines Membranproteins unabhängig von seiner natürlichen Umgebung untersuchen, so muss man es zunächst aus dieser herauslösen. Dieser als Solubilisieren bezeichnete Vorgang geschieht durch Zugabe einer amphiphilen Substanz, einem sogenannten Detergens. Vergleiche hierfür Abbildung 10.1 aus dem Skript 10 Theorie Solubilisierung biologischer Membranen und Aktivitätstests von mitochondrialen Atmungskettenkomplexen. Nun können Protein- und Lipidkomponenten mit den in der Proteinchemie üblichen Trennmethoden wie Chromatographie, Dichtegradientenzentrifugation usw. abgetrennt werden. Zur Untersuchung der Funktion des isolierten Membranproteins ist es meistens nötig, dieses wieder in eine Lipiddoppelschicht einzubetten. Diesen Prozess, der mit der Entfernung des Detergens einhergeht, bezeichnet man als Rekonstitution. Man kann sowohl planare, künstliche Membranen als auch sphärische Lipiddoppelschichten mit einem flüssigkeitsgefüllten Innenraum erzeugen. Letztere nennt man oftmals Vesikel oder Liposomen (siehe Abbildung 2.1). Abbildung 2.1: Lipidvesikel mit eingebautem Membranprotein Im Fall von BR, das in seiner natürlichen Umgebung in die sehr stabile, planare PM eingebettet ist, kann man die Rekonstitution in die Vesikel auch durch Mischen der reinen Liposomen mit der PM und anschließendes transientes Aufreißen der Liposomenmembran durch einfrieren und auftauen erreichen, d. h. die Solubilisierung kann entfallen. 2

3 Durchführung Zuerst wird das vorgereinigte Sojabohnenlipidgemisch Asolectin für die Liposomen vorbereitet, indem man ca. 20 mg Asolectin (lagert bei bei 4 C) in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß einwiegt und in 500 µl 150 mm KCl löst. Dafür wird die Probe zuerst gevortext und anschließend für mindestens 1 h (gerne auch länger) in einem Ultraschallbad beschallt, bis sich eine milchige Suspension gebildet hat. Erfahrungsgemäß wird sich das Asolectin nicht vollständig lösen, aber die sich einstellende Suspension reicht für die Rekonstitution aus. BR_Sol wird bereits vor dem Versuch von den Betreuern angesetzt, weil die Lösung für eine effiziente Solubilisierung 3 Tage bei 4 C im Dunkeln (Abdeckung mit Alufolie) rühren muss. Als Detergens dient n-octyl-ß-glucopyranosid. Die Theorie zur Solubilisierung von Membranproteinen findet sich im Praktikumsskript 10 Theorie Solubilisierung biologischer Membranen und Aktivitätstests von mitochondrialen Atmungskettenkomplexen. BR_Sol Ansatz (wird bereitgestellt) Bacteriorhodopsin in Purpurmembran n-octyl-ß-glucopyranosid (292,38 g/mol) Kaliumphosphatpuffer (1 mm), ph 7,2 2,5 mg/ml 50 mg/ml 0,5 mm Volumen auffüllen mit H 2 O Nachdem die Lösung für drei Tage im Kühlschrank bei Dunkelheit gerührt hat, werden nicht solubilisierte Membranreste durch Zentrifugation für 1 h bei x g und 4 C in der Ultrazentrifuge entfernt. Für BR_FT wird die Ausgangssuspension bei RT aufgetaut und in einem Eppendorf- Reaktiongefäß eine 3,86 mg/ml Lösung in 150 mm KCl hergestellt (Gesamtvolumen 1 ml). Aufgrund der hohen Konzentration der Ausgangssuspension (viskos), sollten nicht mehr als 500 µl gleichzeitig pipettiert werden. BR-FT Ansatz Bacteriorhodopsin in Purpurmembran 3,86 mg/ml Volumen von 1 ml auffüllen mit 150 mm KCl Die Konzentration von 3.86 mg/ml ergibt eine Absorption von ca. 0,9 im Spektrometer (d = 0,1 cm), ist für photometrische Untersuchungen demnach eine ausreichend Verdünnung. Zur Konzentrationsbestimmung für die Rekonstitutionsansätze werden UV/VIS-Spektren der BR-Stammlösungen BR_FT und BR_Sol in Quarzküvetten (d = 1 mm) aufgenommen und zur weiteren Berechnung die entsprechenden Werte für die Absorptionsmaxima des Retinals notiert. Hierbei sei zu beachten, dass sich die Extinktionskoeffizienten jeweils auf die belichtete BR-Probe beziehen und deshalb die Küvette vor der Messung nochmal mit einer Lampe belichtet werden muss. Für die Baseline wird eine Küvette mit 300 µl H 2 O verwendet. Die zweite Küvette wird mit 300 µl BR_FT und die dritte Küvette mit 300 µl BR_Sol befüllt. Die Küvetten werden für die Messung linksbündig in die Küvettenhalterung gestellt sodass sie nicht durch Schrägplazierung in der Halterung für zusätzliche Lichtstreuung und -reflektion sorgen. 3

4 Messparameter: λ = 700 nm 250 nm, scan speed = medium. Nach der Messung werden die BR-Lösungen mit gel loader tips aus den Küvetten und zur weiteren Verwendung wieder zurück in die Eppis mit den Stammlösungen BR_Sol und BR_FT pipettiert. Die Küvetten werden gereinigt, indem man 5 mal H 2 O hinein pipettiert und wieder herausholt. Hinterher werden sie mit Druckluft von innen getrocknet und mit angefeuchteten fusselfreien Reinigungstüchern ( Kimwipes ) von außen gereinigt und abgetrocknet. An dieser Stelle ergeht nochmal der Hinweis mit den teuren Quarzküvetten vorsichtig umzugehen! Zur Berechnung der Reinheit der Probe im Protokoll soll zusätzlich der Wert für das Absorptionsmaximum der aromatischen Aminosäuren notiert werden. Während alle Proteine mit ihren aromatischen Aminosäuren zu diesem Peak beitragen, resultiert der Peak bei 568 nm durch das Retinal im BR. Setzt man diese beiden Peaks ins Verhältnis, kann man auf die Reinheit der Probe, d.h. wieviel der Proteinmenge auf BR zurückgeht, schließen. Eine vollständig ideale, reine Probe ergibt hierfür den Wert 1,5. Des Weiteren sollen im Protokoll die Absorptionsspektren von BR_Sol und BR_FT miteinander verglichen werden. Zu diesem Zweck werden beide Spektren ausgedruckt. Welche Absorptionsmaxima sind dabei jeweils zu sehen? Welches Absorptionsmaximum könnte zu sehen sein, wenn die Probe nicht mehr intakt ist und wie unterscheiden sich die Hintergründe der Spektren? Und natürlich: warum? Anschließend werden die Ansätze für die Rekonstitution ausgerechnet. Extinktionskoeffizient des solubilisierten BR: M -1 cm -1 bei 550 nm. Extinktionskoeffizient von lichtadaptiertem BR in PM: M -1 cm -1 bei 568 nm. Molmasse von BR: g/mol Es ist möglich, dass beide Rekonstitutionsmethoden parallel durchgeführt werden (von unterschiedlichen Personen) Freeze-Thaw-Methode 1 mg BR_FT wird mit 3 mg ( = 75 µl) Asolectin-Liposomen und 150 mm KCl-Lösung in einem Glühröhrchen vermischt, so dass ein Gesamtvolumen von 1 ml resultiert. Bei dieser Methode wird BR aus PM durch dreimaliges langsames Einfrieren unter kräftigem Schütteln in flüssigem Stickstoff (-196 C, Schutzbrille! Hier Latex- und Nitrilhandschuhe aus und auch auf benachbarte Studenten achten!) und jeweils zwischenzeitliches Erwärmen (wieder auftauen) auf Raumtemperatur in die Membran der Lipid-Vesikel eingebaut. Die Wiederholung dieser Prozedur dient der Erhöhung der Zahl eingebauter BR-Moleküle. Kurzes Beschallen im Ultraschallbad (ca. 20 sec) der aufgetauten Probe zwischen den einzelnen Einfrier-Schritten überführt multilamellare Vesikel in unilamellare Liposomen. Besonders zu beachten ist die Tatsache, dass der Einfrierprozess mit flüssigem Stickstoff langsam vonstatten gehen soll, um die dadurch resultierenden Eiskristalle zu induzieren, welche die Membranschäden setzen, die eine Überführung des BRs aus der PM in die Liposomen erst ermöglichen (schnelles Einfrieren würde die Probe unbeschadet lassen). Von daher wird die Probe in dem Glühröhrchen nur jeweils kurz eingetaucht, wieder herausgeholt, etwas geschüttelt damit die Probe gleichmäßig einfriert und wieder kurz eingetaucht, herausgeholt, geschüttelt und das solange wiederholt bis die Probe gefroren ist. Anmerkung: die Handhabung mit dem Glühröhrchen geschieht so, dass das Glasgefäß mit Hilfe einer Holzklammer in den Stickstoff gehalten wird. Damit das Röhrchen dabei nicht verrutscht, wird es am Hals bzw. unterhalb der Öffnung mit grünen Tüchern umwickelt und so verdickt und damit besser greifbar für die Holzklammer ist. Weiterhin soll vermieden werden, dass die Tücher beim Beschallen 4

5 zwischen den Frier- und Auftauzyklen nass werden, da infolge dessen die Tücher im flüssigen Stickstoff einfrieren und das Glühröhrchen zum Platzen bringen können Rekonstitution über die Entfernung des Detergens Integrale Membranproteine können durch Zugabe eines Detergens aus ihren Wechselwirkungen untereinander und mit den Membranlipiden befreit werden. Zur Solubilisierung gibt man einen Überschuss an Detergens hinzu, so dass sich in einer Detergensmicelle nicht mehr als ein Proteinmolekül befindet. Als Detergens wird in diesem Versuch n-octyl-ß-d-glucopyranosid verwendet. Nach Zugabe vorgefertigter Asolectin-Liposomen und anschließendem Entfernen des Detergens bilden sich spontan Liposomen aus, die BR enthalten. Die Abtrennung des Detergens erfolgt mit Hilfe der Gelfiltrations-Chromatographie. Mit dieser Methode können rekonstituierte Vesikel innerhalb weniger Minuten erhalten werden. Das BR-Lipid- Detergens-Gemisch wird dazu auf eine mit Sephadex G-25 gefüllte Chromatographie-Säule (Füllhöhe 5 cm, Säulendurchmesser 1,5 cm) aufgetragen. Die durch das Entfernen des Detergens entstehenden Vesikel findet man im Durchbruchvolumen (Void-Volume) der Säule. Man erkennt sie leicht an ihrer purpurnen Farbe. 1 mg solubilisiertes BR_Sol wird mit 3 mg ( = 75 µl) Asolectin-Liposomen in einem Eppendorf- Reaktionsgefäß vermischt. Nachdem man die Säule mit ca. 30 ml 150 mm KCl gespült hat (Einwegpipette verwenden), lässt man den Flüssigkeitsstand bis kurz vor die Fritte laufen (Säule darf nie trocken laufen!) und trägt anschließend die gesamte Probe vorsichtig auf die Säule auf, wartet bis selbige vollständig unter die Fritte gelaufen ist und eluiert mit 150 mm KCl-Lösung. Die farbliche BR-Liposomenfraktion wird gesammelt, wobei das Detergens aufgrund der Kürze der Säule rasch nachkommt. Entsprechend sollte man lieber einen Tropfen der Fraktion weniger sammeln als zu riskieren erneut Detergens in die Probe aufzunehmen. Am Schluss wird die Säule nach Gebrauch nochmal mit ca. 30 ml 150 mm KCl gespült und somit regeneriert für die erneute Verwendung Negativkontrolle Um zu verdeutlichen, dass eine Rekonstitution nicht spontan abläuft und als Negativkontrolle für Folgeexperimente wird eine weitere Probe generiert. Dabei werden analog zur Freeze-Thaw-Methode 1 mg BR_FT mit 3 mg (= 75 µl) Asolectin-Liposomen und 150 mm KCl-Lösung in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß vermischt, so dass ein Gesamtvolumen von 1 ml resultiert. Es erfolgt jedoch keine weitere Nachbearbeitung, sodass eine Rekonstitution ausbleibt. Bis zur weiteren Verwendung werden die rekonstituierten Proben in Alufolie eingepackt und bei 4 C im Kühlschrank gelagert. Nicht entsorgen! 2.2 UV/VIS-Absorptionsspektren von licht- und dunkel-adaptiertem BR Für BR_HD wird die Ausgangssuspension bei RT aufgetaut und in einem Eppendorf-Reaktiongefäß eine 0,25 mg/ml Lösung in 150 mm KCl hergestellt (Gesamtvolumen 1 ml). Da zuerst dunkel adaptiert BR vermessen werden soll, ist diese Lösung bis zur Messung besonders vor Licht zu schützen, indem man sie sorgfältig in Alufolie einpackt und von außen beschriftet. BR_HD Ansatz Bacteriorhodopsin in Purpurmembran 0,25 mg/ml Volumen von 1 ml auffüllen mit 150 mm KCl 5

6 Für die Dunkeladaption wird die eingepackte Probe für mind. 1 h bei ca. 55 C in einem Wasserbad inkubiert. Dies dient der thermischen Beschleunigung des Prozesses der Dunkeladaption (Anmerkung: bei zu hohen Temperaturen kann es zu Aggregation kommen, dagegen hilft Resuspendieren). Anschließend wird BR_HD in einem verdunkelten Raum (zwischen den beiden Laboren bei geschlossenen Türen Absprache mit anderen Gruppen) in eine Küvette gefüllt (V = 1 ml) und auf dem Weg zum Spektrometer mit Alufolie vor Licht geschützt. Die Baseline wird vorher mit H 2 O erstellt. Es wird der Overlay Modus verwendet. Messparameter: λ = 700 nm 250 nm, scan speed = medium. Nach der Aufnahme eines Absorptionsspektrums (dunkeladaptiertes BR) wird die Probe mit einer Lampe belichtet und erneut ein Spektrum aufgenommen (belichtetes BR). Spektren bitte in einem Diagramm darstellen, damit sie sich besser vergleichen lassen. 2.3 Untersuchung des Photozyklus von BR Um den Photozyklus von BR mit einem Absorptionsphotometer zu untersuchen verlangsamen wir den Zerfall des M-Intermediats durch Zugabe der chaotropen Substanz Guanidinhydrochlorid. Ausgehend von der Lösung BR_FT wird durch Verdünnen mit 50 mm Na 2 CO 3 /NaHCO 3 -Puffer (Puffer wird zur Verfügung gestellt, ph 9,4, Lagerung bei -20 C) 1 ml einer PM-Lösung mit A = 1 in einer Küvette (d = 1 cm) hergestellt. In selbiger soll sich zudem eine Endkonzentration von 2 mol/l Guanidinhydrochlorid befinden. Dafür wird eine Stammlösung von 5 mol/l Guanidinhydrochlorid im Natriumcarbonat-Puffer zur Verfügung gestellt, die bei -20 C gelagert wird. Letztlich wird der ph- Wert in der Küvette noch reguliert (basischer), indem man der Lösung 20 µl 1 M NaOH zugibt. Photozyklus Ansatz BR_FT (c so, dass A = 1) 5 mol/l Guanidinhydrochlorid (Endkonz. von 2 mol/l) 1 M NaOH 20 µl 50 mm Na 2 CO 3 /NaHCO 3 -Puffer auf 1 ml auffüllen Der nun verzögert ablaufende Photozyklus lässt sich sogar mit bloßen Augen beobachten. Dafür dunkelt man die Küvette mit den Händen ab (Lösung in der Küvette lila) und hält sie anschließend unter eine Lampe. Dadurch entfärbt sich die Lösung in der Küvette und dieser Effekt soll nun mit Hilfe einer Kinetik (Absorptionsänderung bei einer spezifischen Wellenlänge gegen die Zeit) an einem Absorptionsphotometer untersucht werden. Zu diesem Zweck wird das Shimadzu UV-1650 PC verwendet, da hier die Daten für die Auswertung von einem Rechner und somit im ASCII-Format verfügbar sind. Für alle anderen Spektren werden die Photometer der UVMini-Serie von Shimadzu verwendet. Nach Betätigung von Strg+Alt+Entf kann man sich unter dem Benutzernamen Photometer mit dem Kennwort Biochemie anmelden. Das Bedienprogramm heißt UVProbe Dort kann man unter Window den Messmodus kinetics wählen und anschließend über den Knopf connect das Photometer ansprechen. Ist das Photometer betriebsbereit, können über den Knopf mit dem grünen M auf gelben Grund (oder einfach Strg+M ) sämtliche Messeinstellungen vorgenommen werden: Unter der Registerkarte Measurement wird der timing mode manual mit den units (Einheiten) sec und der cycle time 0,1 (d.h. alle 0,1 sec wird ein Messwert aufgenommen) und einer number of readings von 3001 (bei 3001 Messpunkten, die jeweils nach 0,1 sec aufgenommen werden, ergibt sich dementsprechend eine maximale Messzeit von 300 sec bzw. ca. 5 min) ausgewählt. Der type wird 6

7 als single wavelength festgelegt. Die Kinetik soll zuerst bei 568 nm und anschließend bei 412 nm jeweils bei Raumtemperatur gemessen werden. Anmerkung: falls sich die cycle time nicht unter 1 festlegen lässt, dann muss das Häkchen bei Record Events entfernt werden. Des Weiteren sollte man in den Einstellungen unter der Registerkarte instrument parameters darauf achten, dass S/R Exchange auf normal und nicht invertiert ist, da sonst das Absorptionssignal in die falsche Richtung läuft. Bei dem UV-1650 PC handelt es sich um ein Zweistrahlphotometer, als Referenz dient eine Küvette mit Wasser. Die Baseline wird ebenfalls mit Wasser von 650 nm bis 350 nm aufgenommen, sodass beide vermessenen Wellenlängen in diesem Intervall liegen. Die Messung wird über Start begonnen. Nachdem man sich einen Moment vom stationären Verlauf der Kinetik überzeugt hat, wird der Photozyklus ausgelöst, indem man die Klappe zum Probenraum öffnet und mit einem Photoblitz, der mit einem entsprechenden Filter versehen wurde, die Probe schlagartig mit einer hohen Intensität belichtet. Anschließend wird die Klappe des Probenraums schnell wieder geschlossen. Für praktische Zwecke wird empfohlen, dass eine Person die Klappe, eine andere Person den Photoblitz bedient. Der Verlauf der Kinetik läuft weiter sobald der Probenraum wieder dunkel ist, wird jedoch ein Fehlsignal für den Zeitraum der offenen Klappe zeigen, der für die Auswertung herausgelöscht wird. Der Photoblitz wird für den Betrieb in die Steckdose eingesteckt und dadurch geladen. Falls er voll aufgeladen ist, leuchtet hinten ein Lämpchen. Dann kann der Blitz durch Betätigen des Schalters (wird von links nach rechts geschoben), der vor dem Lämpchen sitzt, ausgelöst werden. Der Blitz kann auch bereits ausgelöst werden, bevor er vollständig aufgeladen ist. Der nachfolgende Kinetikverlauf wird aufgenommen, bis die Ausgangsabsorption wieder erreicht ist. Danach wird der Blitz erneut ausgelöst. Bei Raumtemperatur werden bei jeder der beiden Wellenlängen jeweils 3 Photozyklen ausgelöst. Nach erfolgreicher Messung wird die Kinetik unter File save as einmal als Time course files (.kin) und einmal zur Auswertung als Data Print Table (.txt) im ASCII-Format gespeichert. Unter Properties kann die Kinetik danach gelöscht werden (dadurch wird nicht die gespeicherte Datei gelöscht!). Um den Photozyklus temperaturabhängig zu untersuchen, wird die Küvette mit einem Wasserbad aufgeheizt (maximal 60 C, Resuspendieren nötig falls Proteine aggregieren) und anschließend in die Küvettenhalterung überführt. Nun wird ein Temperaturfühler (Draht) in die Küvette platziert und fixiert, ohne den optischen Weg des Lichts zu behindern. Der Draht kann aus der Probenkammer herausgeführt werden, indem man ihn z.b. rechts an der Ecke der Probenraumklappe herausführt. Selbiger wird von einem Multimeter ausgelesen. Nachdem die Kinetik gestartet wurde, werden während des Abkühlprozesses durch den Einsatz des Photoblitzes Photozyklen des BRs ausgelöst und der Verlauf aufgenommen. Parallel dazu wird beim Blitzen jeweils die aktuelle Temperatur notiert. Es werden Messungen durchgeführt, bis annähernd wieder Raumtemperatur erreicht ist und falls die Messung währenddessen stoppt (weil die 5 min vorbei sind), wird sie neu gestartet. Diese temperaturabhängige Messreihe wird nur bei einer Wellenlänge verlangt (412 nm oder 568 nm). Es wird empfohlen hier zu dritt zusammenzuarbeiten, da in diesen Fall der Erste den Photoblitz bedienen, der Zweite die Klappe des Probenraums öffnen und der Dritte die entsprechende Temperatur notieren kann. Am Ende der Messungen wird das Photometer über den Knopf Disconnect wieder getrennt. Zur Auswertung soll jeweils die Zeitkonstante als Mittelwert der drei ausgelösten Photozyklen bei 568 nm und 412 nm bestimmt werden. Weiterhin soll mit Hilfe der temperaturabhängigen Photozyklusmessung ein Arrheniusgraph erstellt werden. Als Ausgangspunkt dient dabei die 7

8 Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten der chemischen Reaktion 1.Ordnung, das Endergebnis stellt die Aktivierungsenergie dar, die aus dem Arrhenius-Plot bestimmt werden kann. 2.4 Aufgabenstellung Aufnahme und Vergleich eines UV/VIS-Absorptionsspektrums von PM (BR_FT) und von solubilisiertem BR (BR_Sol). Mit Hilfe des molaren dekadischen Extinktionskoeffizienten der Chromophorbande soll die Konzentration von BR und die Reinheit der Probe berechnet werden. Aufnahme und Vergleich von UV/VIS-Absorptionsspektren von licht- und im Wasserbad dunkeladaptierter PM. Rekonstitution von BR in Asolectin-Liposomen nach unterschiedlichen Methoden. Zusätzlich Ansatz einer Negativkontrolle. Messung von Absorptionsänderungen bei 412 nm und 568 nm bei der PM in Gegenwart von Guanidiniumchlorid nach Lichtanregung durch einen Photoblitz bei Raumtemperatur und während des Abkühlprozesses bei verschiedenen Temperaturen. Bestimmung der Zeitkonstanten bei 568 nm und 412 nm bei Raumtemperatur. Erstellen eines Arrheniusgraphen, daraus Ermittlung der Aktivierungsenergie bei der temperaturabhängigen Messung. 8