11 Praxis Solubilisierung biologischer Membranen und Aktivitätstests von Atmungskettenkomplexen

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1 11 Praxis Solubilisierung biologischer Membranen und Aktivitätstests von Atmungskettenkomplexen 11.1 Aufgabenstellung Solubilisierte Membranproteine aus Rinderherzmitochondrien sollen mittels der Blau-nativen (BN) Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt und die Aktivität der beiden Atmungskettenkomplexe NADH:Ubichinon-Oxidoreduktase (Komplex I) und Cytochrom-c-Oxidase (Komplex IV) im Gel bestimmt werden, um eine native Auftrennung der Proteine zu bestätigen. Über die In-Gel Aktivitätstests können individuelle Komplexe sowie Superkomplexe identifiziert werden Gießen von nativen Gradientengelen Zusammenbau der Gelapparaturen und Allgemeines zur praktischen Durchführung einer Elektrophorese siehe Skript 7 Praxis zur nativen und denaturierenden Polyacrylamidgelelektrophorese. Bitte unbedingt vorher lesen! Es werden mittlere Gele mit einer Dicke von 1,5 mm gegossen. Dazu werden Glasplatten mit einer Größe von 10,1 x 10,6 cm und den entsprechenden Keramikplatten verwendet. Es stehen folgende Acrylamid-Lösungen zur Verfügung (Lagerung bei 4 C): Gel A Gel B 30%ige Lösung (w/v) von Acrylamid 2%ige Lösung (w/v) von N,N -Methylenbisacrylamid HINWEIS: Acrylamid ist giftig! Verwendete Glaspipetten müssen mit Isopropanol gespült werden (Flüssigabfallkanister) und dürfen erst danach in den Köcher für benutzte Pipetten gegeben werden. Pipettenspitzen und Plastikpasteurpipetten in acrylamidhaltigen Feststoffabfall geben. Als Puffer sind vorhanden [1]: (Lagerung bei 4 C) Bis-Tris-BN-Gelpuffer oben (3x konz.) 150 mm Bis-Tris 600 mm 6-Aminocapronsäure ph-wert mit HCl auf 7,0 einstellen Bis-Tris-BN-Anodenpuffer 50 mm Bis-Tris (M=209,24 g/mol) ph-wert mit HCl auf 7,0 einstellen (Lagerung bei -20 C) APS-Lösung 10% (w/v) APS Bis-Tris-BN-Gelpuffer unten (3x konz.) 150 mm Bis-Tris 600 mm 6-Aminocapronsäure 60 % Glycerol ph-wert mit HCl auf 7,0 einstellen Bis-Tris-BN-Kathodenpuffer 15 mm Bis-Tris (M=209,24 g/mol) 50 mm Tricin (M=179,17 g/mol) 0,002% (w/v) CBBG ph 7,0 stellt sich ein Zunächst ist die Zusammensetzung der Lösungen für die Polyacrylamidgele auszurechnen (Tab ). Außerdem sollte die einwandfreie Funktion des Gradienten-Aufbaus im Kühlschrank kontrolliert werden. Hierbei wird Wasser in den Gradientenmischer gefüllt und über die Pumpe in ein Becherglas transportiert. Im Schlauch muss noch Wasser verbleiben (ca. 10 cm Schlauchlänge), das die Gellösung später überschichtet. 1

2 Tab. 11.1: Zusammensetzung der Gellösungen für die blau-native Elektrophorese. Es sollen je 6 ml Trenngellösung vorbereitet werden für einen Gradienten von 3 bis 13% T. Jeweils 5 ml der Trenngellösungen werden in eine Kammer der Gießapparatur gegossen. Trenngel oben (6 ml, T=3%, C=3%) Gel A [ml] Gel B [ml] 3x Gelpuffer oben [ml] VE-H 2 O [ml] Trenngel unten (6 ml, T=13%, C=3%) Gel A [ml] Gel B [ml] 3x Gelpuffer unten [ml] VE-H 2 O [ml] TEMED [µl] 3,06 TEMED [µl] 1,97 APS [µl] 30,6 APS [µl] 19,7 5 ml der höherprozentigen Trenngellösung kommen in die hintere Kammer des Gradientenmischers und 5 ml der niederprozentigen Lösung in die vordere, damit durch Unterschichten ein Polyacrylamidgradient von 3-13% entsteht. Die Gellösung wird mittels eines Auslaufschlauches an dessen Ende sich eine Kanüle befindet, die am Rand bis auf den Boden der Gelkassette positioniert ist durch eine Pumpe in die Gelkassette transportiert (siehe Abb. 11.1). Das Gießen des Gels erfolgt im Kühlschrank mit einer Pumprate von 10 U min -1. Wenn das Trenngel gegossen ist, muss die Kanüle sofort vorsichtig herausgezogen werden. Anschließend wird der Gradientenmischer mit Wasser gefüllt und zum Reinigen der Schläuche und Kanüle angeschaltet. Zur vollständigen Polymerisation sollte die Gießkammer für ca. 1 h bei Raumtemperatur in den Abzug gestellt werden. Danach ist das Sammelgel anzusetzen und nach TEMED- und APS-Zugabe in die Gelkassette zu pipettieren. Direkt nach Einfüllen der Sammelgellösung sollte der Taschenkamm eingesetzt werden. BN-Gele müssen mind. über Nacht nachpolymerisieren, bevor man sie verwenden kann. Die Lagerung erfolgt in feuchte Tücher und Alufolie gewickelt bei 4 C (beschriften nicht vergessen). Tab. 11.2: Zusammensetzung des Sammelgels für die blau-native Elektrophorese. Sammelgel (6 ml, T=3%, C=3%) Gel A [ml] Gel B [ml] 3x Gelpuffer oben [ml] VE-H 2 O [ml] TEMED [µl] 4,89 APS [µl] 48,9 Abb. 11.1: Versuchsaufbau zum Gießen von Gradientengelen [1]. 2

3 11.3 Solubilisierung von Proteinen aus Rinderherzmitochondrien 2x Solubilisierungspuffer (1 ml Aliquot, lagert bei -20 C) 60 mm HEPES / KOH ph mm Kaliumacetat 20 % Glycerin in MilliQ-H 2 O, sterilfiltriert Puffermix (ansetzen, auf Eis stellen, KEIN Digitonin zugeben, wird später frisch zur Probe gegeben) 2x Solubilisierungspuffer 500 µl -20 C Proteaseinhibitorcocktail (PIC) (0,5%) 5 µl -20 C VE-H 2 O 395 µl total 900 µl (theoretisch: +10%ig Digitonin 100 µl) Pulver: RT (theoretisch: total 1000 µl) Leere-Taschen-Lösung (ansetzen, auf Eis stellen) 180 µl Puffermix 20 µl 10% Digitonin Den Heizblock für Eppis auf 95 C heizen (dauert etwa 20 min.). Die Zentrifuge (VWR Microstar 17R) auf 4 C vorkühlen (dauert etwa 20 min., siehe Betriebsanleitung S. 4-6). 10%ige Digitoninlösung Ein Digitonin Aliquot (10-15 mg, lagert bei RT, Achtung toxisch!) nehmen und das 9-fache Volumen VE- Wasser (in µl!!!) hinzufügen. Das Eppi im Heizblock auf C für ca. 30 Minuten heizen, bis das komplette Digitonin gelöst ist. Alle weiteren Schritte werden auf Eis durchgeführt, Puffer vorkühlen, leere Eppis vorkühlen, damit die Proteine nicht denaturieren (es sollen ja Aktivitätstests durchgeführt werden). Es werden 100 µg Rinderherzmitochondrien (BHM, c = 25,88 mg/ml, -20 C) zum Solubilisieren verwendet. Ein Aliquot (à 100 µg) aus -80 C Tiefkühlschrank, 5. Stock, AG Dencher abholen (wird von Betreuern ausgegeben, Eis mitbringen). BHM liegt in einer Lagerlösung vor, die erst durch Solubilisierungspuffer ersetzt werden muss (Pufferwechsel). Hierfür 300 µl 1x Solubilisierungspuffer (aus 2x Solubilisierungspuffer ansetzen) in einem Eppi vorlegen. BHM auf Eis auftauen lassen, die richtige Menge abnehmen und im vorgelegten 1x Solubilisierungspuffer resuspendieren und vortexen. Anschließend zentrifugieren: 4 C, x g, 10 min. In dem Pellet sind die Mitochondrien, der Überstand besteht aus Lagerlösung und Sol.-Puffer. Der Überstand wird vorsichtig abpipettiert. (Tipp: die Pellets sind sehr klein, kaum sichtbar, es ist sinnvoll, sich zu merken, wie man die Eppis in die Zentrifuge gestellt hat!). Zum Solubilisieren von Proteinen muss zunächst die benötigte Menge an Digitonin und Puffermix ausgerechnet werden. Solubilisiert wird mit 3 g Digitonin pro g Protein, im Eppi soll am Ende nur 1% Digitonin vorliegen, aber das Digitonin wird frisch in Form von 10%iger Lösung zum Puffermix zugegeben. Die Rechnung sieht so aus: 3

4 Rechnung für die Digitonin- und Puffermix-Menge: 1 g/g 1 µl/100µg Protein 10%ige Digitonin Lösung 3 3 g/g 3 µl/100µg Protein 10%ige Digitonin Lösung 10 3 g/g 30 µl/100µg Protein 1%ige Digitonin Lösung 27 µl Puffermix + 3 µl 10%ige Digitonin Lösung Das Mito-Pellet wird in der entsprechenden Menge Puffermix resuspendiert. Jetzt wird die berechnete Menge 10%ige Digitoninlösung (auf Eis gekühlt, nicht heiß!) hinzugegeben und gevortext. Innerhalb von 30 min. werden die Proteine aus der Membran solubilisiert. Hierfür alle 5-10 min. vortexen. WICHTIG: immer alles auf EIS stehen lassen. Die Proteine sind nach der Solubilisierung in Lösung!!! Am Ende wird überschüssiges Zellmaterial, Membranreste etc. bei 4 C, x g, 12 min. abzentrifugiert. Die Proteine befinden sich nun im Überstand, welcher in ein vorgekühltes Eppi überführt wird. Sie können nun auf ein BN-Gel aufgetragen werden. Das BN-Gel wird aus dem Kühlschrank genommen, in eine Laufapparatur gespannt, BN-Anodenpuffer unten und BN-Kathodenpuffer (0,002% CBBG-250) oben eingefüllt. Die Taschen werden mit dem Kathodenpuffer gespült. Beim Laden werden in drei Taschen jeweils 30 µg (Volumina vorher ausrechnen) solubilisierte BHM-Proteine aufgetragen. In eine Tasche werden 2 µl HMW-Marker und 25 µl leere-taschen-lösung geladen, die restlichen Taschen werden mit 25 µl leere-taschen-lösung gefüllt. Dies ermöglicht eine gerade Lauffront, da Digitonin das Laufverhalten ändert. Das Kathodenvorratsgefäß nun bis oben mit Kathodenpuffer füllen (vorsichtig mit einer Plastikpipette, damit die Proben nicht ausgeschwemmt werden). Auf die Elektrophoreseapparatur den Deckel mit den Anschlusskabeln setzen (rot zu rot und schwarz zu schwarz) und in den Kühlschrank stellen. Die Kabel werden an ein Power Supply angeschlossen. Einstellung für den Lauf: 15 ma pro Gel, 100 V zum Einlaufen ins Trenngel und später 250 V zum Lauf durch das Trenngel. (VORSICHT: HOCHSPANNUNG!) Wenn die Coomassielauffront ausgetreten ist, den Power Supply ausschalten, Gelapparatur abnehmen und auseinanderbauen. Tipp: Während des Laufs können die Aktivitätstest-Lösungen aufgetaut werden. Direkt nach dem Lauf das Gel auseinanderschneiden: eine Spur BHM und HMW zusammen in Coomassie-R250 Färbelösung legen und mit den beiden restlichen BHM-Spuren die Aktivitätstests anfangen (siehe unten). ENTSORGUNGSHINWEIS: Digitonin ist toxisch - alle Eppi-Gefäße mit Digitonin in den aufgestellten Sammelbehälter für Feststoffabfall entsorgen, Flüssigabfall mit Digitonin und Reste vom blauen Kathodenpuffer in den Flüssigabfall kippen. 4

5 11.4 In-Gel Aktivitätstests der Atmungskettenkomplexe BN-Gelstreifen mit solubilisiertem BHM werden mit den entsprechenden Aktivitätstestlösungen inkubiert, bis sich farbiger Niederschlag zeigt. Die Aktivitätstestlösungen werden zur Verfügung gestellt und befinden sich bei -20 C. Bitte 400 ml Stopp/Fixierlösung für zwei Gruppen zusammen ansetzen. Zum Schluss werden die fertigen Gelstreifen eingescannt und die Banden auf dem Gelbild entsprechend Abb beschriftet Aktivitätstest für Komplex I Zuerst wird das zu untersuchende Gel 10 min. in VE-H 2 O gewaschen. Dann wird es unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur im Testpuffer inkubiert, bis die Färbung (violett-blau) der entsprechenden Proteinbanden ausreichend sichtbar ist (etwa 30 bis 60 min.). Ein kurzer Inkubationsschritt (15 min) in Stopp/Fixierlösung beendet die Reaktion und die Proteine werden im Gel fixiert. Abschließend wird das Gel gescannt (5. Stock, AG Dencher) und entsprechend Abb beschriftet. Die Zusammensetzung der Testlösung ist in folgender Tabelle angegeben, sie ist bereits angesetzt und lagert bei -20 C: Testpuffer für NADH-Dehydrogenase-Aktivität (Untereinheit von Komplex I) [2]: Aktivitätstestlösung für Komplex I Substanz MW [g/mol] Lager-T 100 mm Tris 121,14 RT 768 mm Glycin 75,07 RT } ph 7,4 einstellen 0,49 mm NBT/NTB 817,65 +4 C 0,1 mm -NADH (reduziert) 709,4 +4 C Nach Verwendung wird der Rest Aktivitätspuffer im Flüssigabfallkanister entsorgt. Die Stopp/Fixierlösung ist für Test I und IV identisch, insgesamt 200 ml pro Gruppe ansetzen. Stopp/Fixierlösung 50 % (v/v) Methanol 10 % (v/v) Essigsäure Aktivitätstest für Komplex IV Das Gel wird zunächst 10 min. in VE-Wasser gewaschen und dann bei Raumtemperatur in der Testlösung geschüttelt, bis eine braune Färbung der Banden zu sehen ist (max. 60 min.). Danach wird 15 min. in Stopp/Fixierlösung abgestoppt und fixiert. Anschließend wird ein Bild vom Gel gescannt (5. Stock, AG Dencher) und die Banden entsprechend Abb beschriftet. Testpuffer für Cytochrom-c-Oxidase (Komplex IV) [3] (lagert fertig bei -20 C): Aktivitätstestlösung Komplex IV Substanz MW [g/mol] Lager-T 50 mm Na 3 PO 4 12 H 2 O 380,12 RT } ph 7,2 einstellen 0,025 mm Cytochrom c, bovine heart C 1,58 mm DAB (lichtempfindlich!) 360,12 +4 C Stopp/Fixierlösung (siehe Komplex I Aktivitätstest) ENTSORGUNGSHINWEIS: ALLE Lösungen in den bereitgestellten Flüssigabfallbehälter entsorgen!!! 5

6 11.5 Coomassiefärbung von Gelen Ähnlich wie Coomassie Brillant Blau G-250 (CBBG), bindet auch der Farbstoff Coomassie Brillant Blau R-250 an Proteine. Zusammen mit Kupfer-Ionen ergibt sich eine intensive Färbung der Proteinbanden. Die Nachweisgrenze liegt hier bei etwa 0,3 µg pro Bande. Die in der Färbelösung enthaltene Essigsäure sorgt hierbei für eine Fixierung der Proteine im Gel. Folgende Lösungen sind vorhanden: Lösung A 5 g CuSO 4 5 H 2 O 100 ml Essigsäure 400 ml VE-Wasser Coomassie-Brillant-Blau R-250 Färbelösung Lösung B 1,5 g Coomassie Brillant Blau R ml VE-Wasser 450 ml Ethanol Lösungen A und B im Verhältnis 1:1 mischen, über Nacht rühren, danach filtrieren Folgende Lösung ist anzusetzen: Entfärbelösung (falls nicht schon wegen SDS-PAGE vorhanden) 2,5 g CuSO 4 5 H 2 O in ca. 250 ml VE-Wasser lösen 50 ml Essigsäure 125 ml Methanol mit VE-Wasser auf 500 ml auffüllen Nach der Elektrophorese inkubiert man das Gel unter leichtem Schütteln für ca. 10 min in Entfärbelösung und dann für mind. 1 h oder über Nacht in der Färbelösung. Die Färbelösung wird anschließend wieder in den Vorratsbehälter zurückgeschüttet. Die die Entfärbung erfolgt so lange, bis der Hintergrund des Gels farblos ist. Die Entfärbelösung ist bei Bedarf mehrmals auszutauschen (Entsorgung in Flüssigabfallkanister). Nach der Entfärbung wird das Gel gescannt (5. Stock, AG Dencher) und entsprechend Abb beschriftet Quellen [1] Krause, F. und H. Seelert, Detection and Analysis of Protein-Protein Interactions of Organellar and Prokaryotic Proteomes by Blue Native and Colorless Native Gel Electrophoresis, in Current Protocols in Protein Science, J.E. Coligan, et al., Hrsg [2] Grandier-Vazeille, X. und Guérin, M., Anal. Biochem. 242, (1996). [3] Wittig, I., et al., Electrophoresis, 28, (2007). 6