Blut DNA Midi Kit. Datenblatt. (Nur für Forschung und in vitro-anwendungen) Chargen-Nr.: Mindestens haltbar bis: Aussehen: Farbe: Bio&SELL

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1 Datenblatt Artikel-Nr. BS Artikel-Nr. BS Artikel-Nr. BS Präparationen 50 Präparationen 250 Präparationen (Nur für Forschung und in vitro-anwendungen) Chargen-Nr.: Mindestens haltbar bis: Aussehen: Farbe: 1

2 Beschreibung Säulchen basierte Extraktion von DNA aus Vollblut mit hohem Wirkungsgrad. Enthalten sind, neben allen benötigten Puffern, auch genaue Protokolle zur Verarbeitung unterschiedlicher Gesamtblut-Ausgangsmengen. Wichtige Hinweise zur Lagerung Alle Komponenten, bis auf die Proteinase K, sollten bei Raumtemperatur gelagert werden Lagerung der lyophylisierten Proteinase K bei -20 C Lagerung der gelösten Proteinase K bei -20 C; die Lagerung in Aliquots wird empfohlen, da wiederholtes Einfrieren und Auftauen die Aktivität des Enzyms drastisch reduziert 2

3 Kit-Komponenten 10 Präparationen 50 Präparationen 250 Präparationen Ery-Lysepuffer A Ery-Lysepuffer B Lysepuffer TLS Fällungspuffer Proteinase K Waschpuffer MS Elutionspuffer Zentrifugationssäulen Sammeltubes 2,0 ml Elutionstubes 1,5 ml 60 ml 2 x 140 ml 2 x 700 ml 60 ml 2 x 140 ml 2 x 700 ml 2 x 2 ml 15 ml 60 ml 1 ml 3 x 2 ml 25 ml für 0,3 ml Arbeitslösung 3 ml (Endvolumen 10 ml) für 1,5 ml Arbeitslösung 15 ml (Endvolumen 50 ml) für 5 x 1,5 ml Arbeitslösung 60 ml (Endvolumen 200 ml) 3 x 2 ml 25 ml 2 x 60 ml x x x x 50 3

4 Wichtige Schritte vor Beginn Zugabe von 96 99,8% Ethanol zu Waschpuffer MS. Die entsprechenden Volumina je nach Kit Größe entnehmen Sie der nachfolgenden Tabelle. Gründlich mischen und Flasche stets dicht verschlossen halten. Lösen Sie die Proteinase K durch Zugabe von ddh 2 O. Die entsprechenden Volumina je nach Kit Größe entnehmen Sie der nachfolgenden Tabelle. Gründlich mischen. Waschpuffer MS Proteinase K 10 Präparationen 7 ml 96 99,8% Ethanol zugeben 0,3 ml ddh 2 O 50 Präparationen 35 ml 96 99,8% Ethanol zugeben 1,5 ml ddh 2 O 250 Präparationen 140 ml 96 99,8% Ethanol zugeben 1,5 ml ddh 2 O Heizen Sie einen Thermomixer oder ein Wasserbad auf 70 C vor Stellen Sie sicher, dass Waschpuffer, Waschpuffer und die Proteinase K gemäß der obigen Instruktionen vorbereitet sind Alle Zentrifugationsschritte sollten bei Raumtemperatur durchgeführt werden Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen des Ausgangsmaterials 4

5 Nicht im Kit enthaltene Komponenten Optional: RNase A (100 mg/ml) 2,5 ml oder 15 ml Reaktionsgefäße 1,5 ml Reaktionsgefäße ddh 2 O 96 99,8% Ethanol 70% Ethanol Qualitätskontrolle und technische Unterstützung Alle Produkte von werden umfassenden Qualitätskontrollen unterzogen. Dadurch wird gewährleistet, dass sie bei vorschriftsmäßiger Anwendung einwandfrei funktionieren. Die Komponenten jedes Blut DNA Midi Kit wurden in der Isolierung von genomischer DNA aus Vollblut getestet, die extrahierte DNA wurde amplifiziert sowie durch Gelelektrophorese und Spektrophotometrie analysiert. Sollten Fragen oder Probleme auftreten, kontaktieren Sie uns bitte telefonisch unter: Wir behalten uns das Recht vor, Änderungen zur Verbesserung der Durchführung und am Design vorzunehmen. 5

6 Protokoll 1: Isolierung von DNA aus Gesamtblut (0,5 1,0 ml) 1. 0,5 1,0 ml des Gesamtblutes in ein 2,0 ml Reaktionsgefäß überführen. 1 ml des Ery-Lysepuffers A zugeben, kurz vortexen und bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren. Bei x g für 3 min zentrifugieren. Den Überstand sehr vorsichtig abnehmen und verwerfen. Das Pellet nicht verwerfen! 2. 1 ml des Ery-Lysepuffers B zugeben. Die Probe für 10 Sekunden vortexen. Bei x g für 2 min zentrifugieren. Den Überstand sehr vorsichtig abnehmen. Das Pellet nicht verwerfen! µl Lysepuffer TLS und 25 µl Proteinase K zugeben. Durch mehrmaliges Vortexen für insgesamt 10 Sekunden gründlich mischen. Bei 70 C für 10 min inkubieren, bis das Pellet vollständig lysiert ist, möglichst unter Schütteln (z.b. in einem Thermomixer). Falls ein kontinuierliches Schütteln nicht möglich ist, die Probe während der Inkubation 3 4mal vortexen. Hinweis: Schütteln bzw. Vortexen ist essentiell für eine erfolgreiche Lyse. Falls das Pellet nicht vollständig lysiert ist, wird dies die finale Ausbeute drastisch reduzieren! µl Fällungspuffer zu der lysierten Probe geben und durch mehrmaliges Vortexen für insgesamt 10 Sekunden gründlich mischen. Die Lösung muss eine milchige Farbe bekommen. Falls sich die Farbe nicht ändert, weiter Vortexen. Die Fällung kann durch optionale Inkubation des Reaktionsgefäßes für 1 min auf Eis unterstützt werden. Bei 6

7 maximaler Geschwindigkeit für 3 min zentrifugieren. Den klaren Überstand in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführen. Kontamination mit dem Präzipitat vermeiden! µl 70% Ethanol zu der Probe geben und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gründlich mischen, bis eine homogene Lösung entsteht. 6. Eine Zentrifugationssäule in ein 2,0 ml Sammeltube stellen. Die Probe auf die Säule geben. Den Deckel verschließen und bei x g ( rpm) für 2 min zentrifugieren. Hinweis: Falls der Überstand nicht komplett durch die Membran zentrifugiert wurde, nochmals bei höherer Geschwindigkeit zentrifugieren oder die Zentrifugationszeit verlängern. Das Sammeltube mit dem Durchfluß verwerfen. Zentrifugationssäule in ein neues 2,0 ml Sammeltube stellen. 7. Zentrifugationssäule öffnen und 750 µl Waschpuffer MS zugeben. Den Deckel verschließen und bei x g ( rpm) für 1 min zentrifugieren. Das Sammeltube mit dem Durchfluß verwerfen. Zentri-fugationssäule in ein neues 2,0 ml Sammeltube stellen. 8. Bei maximaler Geschwindigkeit für 2 min zentrifugieren, um alle Reste von Ethanol vollständig zu ent-fernen. Das Sammeltube mit dem Durchfluß verwerfen. Zentrifugationssäule in ein 1,5 ml Elutionstube stellen. 7

8 9. Zentrifugationssäule öffnen und µl Elutionspuffer zugeben. Bei Raumtemperatur für 1 min inkubieren, dann bei x g ( rpm) für 1 min zentrifugieren. Für eine maximale Ausbeute an DNA können zwei Elutionsschritte mit gleichen Volumina Elutionspuffer durchgeführt werden. Hinweis: Falls der Elutionspuffer nicht komplett durch die Membran zentrifugiert wurde, nochmals bei höherer Geschwindigkeit zentrifugieren oder die Zentrifugationszeit verlängern. Die DNA kann auch mit geringeren oder mit höheren Volumina an Elutionspuffer eluiert werden als oben angegeben. Bei geringeren Volumina an Elutionspuffer erhöht sich die Endkonzentration der DNA. Die extrahierte DNA sollte bei 4 C aufbewahrt werden. Für Langzeitlagerung wird eine Temperatur von - 20 C empfohlen. Protokoll 2: Isolierung von DNA aus Gesamtblut (1,0 2,0 ml) 1. 1,0 2,0 ml des Gesamtblutes in ein 15 ml Reaktionsgefäß überführen. 5 ml des Ery-Lysepuffers A zugeben, kurz vortexen und bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren. Bei x g für 3 min zentrifugieren. Den Überstand sehr vorsichtig abnehmen und verwerfen. Das Pellet nicht verwerfen! 2. 5 ml des Ery-Lysepuffers B zugeben. Die Probe für 10 Sekunden vortexen. Bei x g für 2 min zentrifugieren. Den Überstand sehr vorsichtig abnehmen. Das Pellet nicht verwerfen! 8

9 µl Lysepuffer TLS und 25 µl Proteinase K zugeben. Durch mehrmaliges Vortexen für insgesamt 10 Sekunden gründlich mischen. Bei 70 C für 10 min inkubieren, bis das Pellet vollständig lysiert ist, möglichst unter Schütteln (z.b. in einem Thermomixer). Falls ein kontinuierliches Schütteln nicht möglich ist, die Probe während der Inkubation 3 4mal vortexen. Hinweis: Schütteln bzw. Vortexen ist essentiell für eine erfolgreiche Lyse. Falls das Pellet nicht vollständig lysiert ist, wird dies die finale Ausbeute drastisch reduzieren! µl Fällungspuffer zu der lysierten Probe geben und durch mehrmaliges Vortexen für insgesamt 10 Sekunden gründlich mischen. Die Lösung muss eine milchige Farbe bekommen. Falls sich die Farbe nicht ändert, weiter Vortexen. Die Fällung kann durch optionale Inkubation des Reaktionsgefäßes für 1 min auf Eis unterstützt werden. Bei maximaler Geschwindigkeit für 3 min zentrifugieren. Den klaren Über-stand in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführen. Kontamination mit dem Präzipitat vermeiden! µl 70% Ethanol zu der Probe geben und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gründlich mischen, bis eine homogene Lösung entsteht. 6. Eine Zentrifugationssäule in ein 2,0 ml Sammeltube stellen. Die Probe auf die Säule geben. Den Deckel verschließen und bei x g ( rpm) für 2 min zentrifugieren. 9

10 Hinweis: Falls der Überstand nicht komplett durch die Membran zentrifugiert wurde, nochmals bei höherer Geschwindigkeit zentrifugieren oder die Zentrifugationszeit verlängern. Das Sammeltube mit dem Durchfluß verwerfen. Zentrifugationssäule in ein neues 2,0 ml Sammeltube stellen. 7. Zentrifugationssäule öffnen und 750 µl Waschpuffer MS zugeben. Den Deckel verschließen und bei x g ( rpm) für 1 min zentrifugieren. Das Sammeltube mit dem Durchfluß verwerfen. Zentrifugationssäule in ein neues 2,0 ml Sammeltube stellen. 8. Bei maximaler Geschwindigkeit für 2 min zentrifugieren, um alle Reste von Ethanol vollständig zu ent-fernen. Das Sammeltube mit dem Durchfluß verwerfen. Zentrifugationssäule in ein 1,5 ml Elutionstube stellen. 9. Zentrifugationssäule öffnen und µl Elutionspuffer zugeben. Bei Raumtemperatur für 1 min inkubieren, dann bei x g ( rpm) für 1 min zentrifugieren. Für eine maximale Ausbeute an DNA können zwei Elutionsschritte mit gleichen Volumina Elutionspuffer durchgeführt werden. Hinweis: Falls der Elutionspuffer nicht komplett durch die Membran zentrifugiert wurde, nochmals bei höherer Geschwindigkeit zentrifugieren oder die Zentrifugationszeit verlängern. Die DNA kann auch mit geringeren oder mit höheren Volumina an Elutionspuffer eluiert werden als oben angegeben. Bei geringeren Volumina an Elutionspuffer 10

11 erhöht sich die Endkonzentration der DNA. Die extrahierte DNA sollte bei 4 C aufbewahrt werden. Für Langzeitlagerung wird eine Temperatur von - 20 C empfohlen. Kalkulation der Zentrifugalkraft (relative centrifugal force, rcf) in [g], ausgehend von Umdrehungen pro Minute (revolutions per minute, rpm) RCF (g) = 1, x (rpm)² x R R = Radius des Rotors in cm (Achtung: Radius, nicht Durchmesser!) Beispiel: Berechnung der Zentrifugalkraft bei rpm in einer Zentrifuge mit Rotor-Radius 9 cm RCF = 1, x (10.000)² x 9 RCF = x g 11

12 Troubleshooting Problem / mögliche Ursache Bemerkungen und Vorschläge Verstopfte Zentrifugationssäule Ungenügende Lyse und/oder zu viel Ausgangsmaterial Lysezeit verlängern. Zentrifugationsgeschwindigkeit erhöhen. Geringeres Volumen an Blut einsetzen Niedrige Ausbeute Ungenügende Lyse Lysezeit verlängern. Geringeres Volumen an Blut einsetzen. Unvollständige Elution Inkubationszeit mit Elutionspuffer auf 5 Minuten verlängern oder Elutionsschritt wiederholen. Elution mit höherem Volumen Elutionspuffer durchführen. Unzureichendes Mischen mit Bindepuffer SBS Auf gründliches Mischen der Probe mit Bindepuffer SBS achten, evtl vortexen. 12

13 Niedrige Konzentration der DNA Zu viel Elutionspuffer Elution mit niedrigerem Volumen Elutionspuffer durchführen. Degradierte oder gescherte DNA Falsche Lagerung des Ausgangsmaterials Altes Ausgangsmaterial Sicherstellen, dass die Blutprobe vor der Präparation richtig aufbewahrt wird. (Sofort nach der Entnahme in flüssigem Stickstoff oder bei mindestens -20 C einfrieren; Langzeitlagerung bei -80 C). Mehrmaliges Auftauen und Einfrieren vermeiden. Alte Blutproben beinhalten stets degradierte DNA oder apoptotische DNA. RNA-Kontamination der DNA Nach Lyse des Pellets und vor der Fällung der DNA RNase A-Verdau durchführen. 4 µl RNase A (100 mg/ml) zu der Probe geben, kurz vortexen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend wie im Protokoll beschrieben weiterarbeiten. 13

14 Technische Daten Sicherheitsanweisungen Bitte gehen Sie mit allen Materialien und Reagenzien, die im Kit enthalten sind, vorsichtig um. Es sollten immer Handschuhe getragen und Hautkontakt vermieden werden! Bei Kontakt mit Augen oder Haut sofort mit viel Wasser abspülen! Versand: bei Raumtemperatur Lagerung: Das Blut DNA Midi Kit sollte trocken und bei Raumtemperatur (14 25 C) gelagert werden. Unter diesen Bedingungen ist es mindestens 6 Monate stabil. Vor jeder Nutzung sollten alle Komponenten Raumtemperatur haben. Kristalle, die sich eventuell während der Lieferung bzw. Lagerung gebildet haben, können durch vorsichtiges Erwärmen gelöst werden. Lagerung der lyophylisierten Proteinase K: bei -20 C Lagerung der gelösten Proteinase K: bei -20 C; die Lagerung in Aliquots wird empfohlen, da wiederholtes Einfrieren und Auftauen die Aktivität des Enzyms drastisch reduziert. Sicherheitshinweis: Dieses Produkt sollte nur von Personen verwendet werden, die Routine in Laboranwendungen haben. Es sollte laborübliche Schutzkleidung wie Kittel, Handschuhe und Schutzbrillen getragen werden. Bei Kontakt mit Haut und Augen sollten die betroffenen Stellen umgehend mit Wasser gewaschen bzw. ausgespült werden. Anwendungshinweis: In bestimmten Ländern sind einige Anwendungen, für die dieses Produkt eingesetzt werden kann, patentrechtlich geschützt. Da durch den Kauf keine Lizenzen erworben werden, kann abhängig vom Anwendungsland und der Anwendung der Erwerb entsprechender Lizenzrechte erforderlich sein. 14

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