Handbuch für den QIAamp DSP Virus Kit

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1 _DE :17 Uhr Seite 1 November 2007 Handbuch für den QIAamp DSP Virus Kit Version 1 Σ 50 IVD Der QIAamp DSP Virus Kit ist ein generisches System, bei dem die QIAamp- Technologie zur Isolierung und Reinigung viraler Nukleinsäuren aus menschlichem Plasma oder Serum für In-vitro-diagnostische-Untersuchungen eingesetzt wird. Für In-vitro-diagnostische Untersuchungen REF H B DE 11/2007 QIAGEN GmbH, D Hilden, Tel: R1 MAT DE Sample & Assay Technologies

2 _DE :17 Uhr Seite 2 Warenzeichen: QIAGEN, QIAamp, QIAvac, MinElute (QIAGEN Gruppe); AMPLICOR HBV MONITOR, AMPLICOR HCV MONITOR, AMPLICOR HIV-1 MONITOR, COBAS, TaqMan (Roche Gruppe); artus, RealArt (artus GmbH); Eppendorf (Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH). Es kann nicht davon ausgegangen werden, dass die in diesem Handbuch verwendeten Markennamen oder Warenzeichen ungeschützt sind, auch wenn sie nicht als Markenname oder Warenzeichen gekennzeichnet sind. Der PCR-Prozess ist für die Hoffmann-La Roche AG durch die US-Patente und sowie durch weitere Patente in anderen Ländern geschützt QIAGEN, alle Rechte vorbehalten.

3 _DE :17 Uhr Seite 3 Inhalt Kit-Inhalt 4 Symbole 5 Lagerung 6 Qualitätssicherung 6 Anwendungsgebiet 6 Anwendungseinschränkungen 7 Sicherheitsinformationen 7 Einleitung 9 Prinzip und Verfahren 9 Vom Anwender bereitzustellende Ausrüstung und Reagenzien 14 Wichtige Hinweise 15 Wichtige Hinweise vor Präparationsbeginn 15 Präparation der RNA 15 Lagerung der Proben 16 Vorbereitung der Reagenzien und Puffer 16 Elution viraler Nukleinsäuren 19 Ausbeute und Qualität viraler Nukleinsäuren 19 Vorbereitung des QIAvac 24 Plus Vakuumsystems 19 Protokoll Isolierung und Reinigung viraler Nukleinsäuren aus Plasma und Serum 22 QIAGEN Distributoren 25 Handbuch für den QIAamp DSP Virus Kit 11/2007 3

4 _DE :17 Uhr Seite 4 Kit-Inhalt QIAamp DSP Virus Kit Katalog-Nr Anzahl der Präparationen 50 QIAamp MinElute QIAamp MinElute Säulen COL mit Wasch-Tubes (WT) (2 ml) 50 EXT Column Extenders (3 ml) COL EXT 50 ET Elution-Tubes(1,5 ml) ELU TUBE 50 VC VacConnectors VAC CON 50 LT Lyse-Tubes (2 ml) LYS TUBE 50 WT Wasch-Tubes (2 ml) WASH TUBE 50 AL Lysepuffer* LYS BUF 33 ml AW1 Waschpuffer1* (Konzentrtrat) WASH BUF 1 CON 19 ml AW2 Waschpuffer 2 (Konzentrtrat) WASH BUF 2 CON 13 ml AVE Elutionspuffer (lila Deckel) ELU BUF 4 x 2 ml PS Protease Solvent (Protease Lösungsmittel) QPROT SOLV 4,4 ml Carrier Carrier RNA (rote Deckel) CAR RNA 310 µg QP QIAGEN Protease QPROT 1 Röhrchen CD H B 1 Handbuch H B 1 * Enthält Guanidinhydrochlorid. Nicht mit Desinfektionsmitteln in Kontakt bringen, die Chlorbleiche (Natriumhypochlorid, NaOCl) enthalten. Weitere Informationen finden Sie auf Seite 7. Enthält Natriumazid als Konservierungsmittel. Resuspendieren Sie den Röhrcheninhalt in einem Volumen von 4,4 ml. 4 Handbuch für den QIAamp DSP Virus Kit 11/2007

5 _DE :17 Uhr Seite 5 2 C 8 C Symbole Σ 50 i IVD REF LOT MAT COMP VOL i Der Kit enthält Reagenzien für 50 Probenpräparationen Informationen im Handbuch Verfallsdatum In-vitro-Diagnostikum Katalognummer Chargennummer Materialnummer Komponenten Volumen Temperaturbeschränkungen Hersteller Nach Erhalt Wichtiger Hinweis Handschuhe wechseln nach einem Protokollschritt mit dieser Markierung Nach Lieferung öffnen; QIAamp MinElute Säulen bei 2 8 C lagern? EtOH ADD CONT LYOPH RCNS EtOH GuHCI SUBT Aktuelles Datum nach Zugabe von Ethanol in die Flasche notieren Zugeben Enthält Lyophilisiert Auflösen in Ethanol Guanidinhydrochlorid Subtilisin Führt zu Handbuch für den QIAamp DSP Virus Kit 11/2007 5

6 _DE :17 Uhr Seite 6 Lagerung QIAamp MinElute Säulen sollten nach Erhalt bei 2 8 C gelagert werden. Alle Puffer können bei Raumtemperatur (15 25 C) gelagert werden. Lyophilisierte Carrier-RNA kann bei Raumtemperatur (15 25 C) bis zu ihrem Verfallsdatum gelagert werden. Carrier-RNA ist nur in Elutionspuffer (AVE) löslich; die gelöste Carrier-RNA sollte sofort zum Lysepuffer (AL) gegeben werden, wie auf Seite 14 beschrieben. Diese Lösung sollte frisch zubereitet werden und ist bei 2 8 C bis zu 48 Stunden lang stabil. Nicht benötigte in Elutionspuffer (AVE) gelöste Carrier-RNA sollte in Aliquoten bei 20 C eingefroren werden. Die lyophilisierte QIAGEN Protease (QP) kann bei Raumtemperatur (15 25 C) bis zu ihrem Verfallsdatum ohne jeglichen Qualitätsverlust gelagert werden. Die gelöste QIAGEN Protease (QP) ist bei 2 8 C 1 Jahr stabil, jedoch nicht über ihr Verfallsdatum hinaus. Gelöster Waschpuffer 1 (AW1) und gelöster Waschpuffer 2 (AW2) sind bei Raumtemperatur (15 25 C) 1 Jahr stabil, jedoch nicht über ihr Verfallsdatum hinaus. Qualitätssicherung Um eine zuverlässige Produktqualität zu gewährleisten, wird jede QIAamp DSP Virus Kit-Charge gemäß dem zertifizierten Total Quality Management System von QIAGEN auf die Einhaltung zuvor festgelegter Spezifikationen geprüft. Anwendungsgebiet Der QIAamp DSP Virus Kit ist ein generisches System, bei dem die QIAamp- Technologie zur Isolierung und Reinigung viraler Nukleinsäuren aus menschlichem Plasma oder Serum für In-vitro-diagnostische-Untersuchungen eingesetzt wird. Alle diagnostischen Ergebnisse, die durch Anwendung des Probenpräparationsverfahrens in Verbindung mit einem diagnostischen NAT-Test erzielt wurden, sind unter Berücksichtigung anderer klinischer Befunde oder Laborergebnisse auszuwerten. Dieses Produkt ist zur Anwendung durch qualifiziertes Fachpersonal (wie etwa Labortechniker und Ärzte, die in molekularbiologischen Techniken geschult sind) bestimmt. Es ist für den Einsatz in Anwendungen vorgesehen, bei denen die enzymatische Amplifikation oder andere enzymatische DNA- oder RNA- Modifikationen mit anschließender Signaldetektion oder amplifikation verwendet werden. Die isolierten und gereinigten viralen Nukleinsäuren können sowohl in qualitativen (z. B. zum Screening von Blutspenden) als auch in quantitativen (z. B. zur Überwachung der Viruslast) diagnostischen NAT-Tests eingesetzt werden. 6 Handbuch für den QIAamp DSP Virus Kit 11/2007

7 _DE :17 Uhr Seite 7 Um Abweichungen der diagnostischen Ergebnisse möglichst gering zu halten, ist das Produkt in Verbindung mit einer internen Kontrolle sowie mit positiven und negativen Kontrollen zu verwenden, die je nach nachfolgendem Test sowohl während der Probenvorbereitung als auch während der Probenamplifikation und detektion mitzuführen sind. Dieses Produkt ist für die Verwendung mit dem QIAvac 24 Plus Vakuumsystem oder einem gleichwertigen Vakuumsystem vorgesehen. Anwendungseinschränkungen Der Kit ist nicht für Blut, Gewebe, Knochenmark oder Zellkulturen geeignet. Der Kit ist ebenfalls nicht zur Isolierung und Reinigung der Nukleinsäuren aus Bakterien, Pilzen und Parasiten geeignet. Die Leistungsfähigkeit des Kits bei der Isolierung und Reinigung viraler Nukleinsäuren aus anderen zellfreien Flüssigkeiten wie Urin und Cerebrospinalflüssigkeit ist nicht untersucht worden. Sicherheitsinformationen Tragen Sie beim Umgang mit Chemikalien immer einen Laborkittel, Schutzhandschuhe und eine Schutzbrille. Weitere Informationen können Sie den entsprechenden Sicherheits-Datenblättern entnehmen. In unserer Online-Sammlung der Sicherheitsdatenblätter unter finden Sie zu jedem QIAGEN Kit und zu jeder Kit-Komponente das jeweilige MSDS (= Material Safety Data Sheet) als PDF-Datei, die Sie einsehen und ausdrucken können. WARNUNG: Geben Sie keine Chlorbleiche oder saure Lösungen direkt in den Flüssigabfall, der während der Probenverarbeitung anfällt. Lysepuffer (AL) und Waschpuffer 1 (AW1) enthalten Guanidinhydrochlorid, das hoch reaktive Verbindungen bilden kann, wenn es mit Chlorbleiche zusammen gebracht wird. Wenn eine Flüssigkeit verschüttet wird, die einen dieser Puffer enthält, reinigen Sie die betroffenen Stellen mit einem geeigneten Labordetergens und Wasser. Enthält die verschüttete Flüssigkeit potenziell infektiöse Agenzien, reinigen Sie die Fläche zuerst mit Labordetergens und Wasser, danach mit 1%igem (v/v) Natriumhypochlorit. Wenn die Pufferflaschen beschädigt oder undicht sind, tragen Sie bei der Entsorgung der Flaschen Schutzhandschuhe und eine Schutzbrille, um Verletzungen jeglicher Art zu vermeiden. QIAGEN hat den Flüssigabfall, der während des QIAamp DSP Virus Verfahrens anfällt, nicht auf infektiöse Stoffe geprüft. Eine Verunreinigung des Flüssigabfalls mit infektiösen Stoffen ist zwar höchst unwahrscheinlich, kann aber nicht vollkommen ausgeschlossen werden. Der Flüssigabfall ist daher als infektiös zu betrachten und gemäß den örtlichen Sicherheitsbestimmungen zu handhaben und zu entsorgen. Handbuch für den QIAamp DSP Virus Kit 11/2007 7

8 _DE :17 Uhr Seite 8 Die folgenden Gefahrenhinweise und Sicherheitsratschläge (R- und S-Sätze) gelten für einzelne Reagenzien des QIAamp DSP Virus Kits: Lysepuffer (AL) und Waschpuffer 1 (AW1) Enthalten Guanidinhydrochlorid: gesundheitsschädlich, reizend. R- und S-Sätze:* R22-36/38, S QIAGEN Protease (QP) Enthält Subtilisin (aus Bacillus subtilis): sensibilisierend, reizend. R- und S-Sätze:* R37/ , S /37/ Stunden-Giftnotruf Im Notfall können Sie 24 Stunden am Tag medizinische Informationen auf Englisch, Französisch und Deutsch erhalten über den: Giftnotruf der Beratungsstelle bei Vergiftungen in Mainz (Deutschland), Tel: * R22: Gesundheitsschädlich beim Verschlucken; R36/38: Reizt die Augen und die Haut; R37/38: Reizt die Atmungsorgane und die Haut; R41: Gefahr ernster Augenschäden; R42: Sensibilisierung durch Einatmen möglich; S13: Von Nahrungsmitteln, Getränken und Futtermitteln fernhalten; S22: Staub nicht einatmen; S24: Berührung mit der Haut vermeiden; S26: Bei Berührung mit den Augen gründlich mit Wasser abspülen und Arzt konsultieren; S36 Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung tragen; S36/37/39: Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung, Schutzhandschuhe und Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen; S46: Bei Verschlucken sofort ärztlichen Rat einholen und Verpackung und Etikett vorzeigen. 8 Handbuch für den QIAamp DSP Virus Kit 11/2007

9 _DE :17 Uhr Seite 9 Einleitung Das QIAamp DSP Virus Protokoll stellt ein etabliertes Verfahren zur gleichzeitigen Isolierung und Reinigung viraler DNA und RNA dar. Es beruht auf einer bewährten Technolgie, welche die selektiven Bindungseigenschaften einer Silicagel-Membran mit einem minimalen Elutionsvolumen von 20 µl oder 60 µl vereint. Der lineare Bereich des QIAamp DSP Virus Verfahrens wurde bei Elutionsvolumina von 20 µl und 60 µl für HIV-RNAund HBV-DNA in mehreren diagnostischen Tests bestimmt (Tabelle 1, Abbildungen 1 und 2). Tabelle 1. Diagnostische Tests, in denen der lineare Bereich des QIAamp DSP Virus Verfahrens ermittelt worden ist Test Real-Time-RT-PCR von HIV-RNA Real-Time-RT-PCR von HBV-DNA Kit TaqMan assay und COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test TaqMan assay und COBAS AMPLICOR HBV MONITOR Test Linearer Bereich des QIAamp DSP Virus Verfahrens ermittelt über TaqMan assays A log result IU/ml y = x R 2 = log input IU/ml B log result IU/ml y = x R 2 = log input IU/ml Abbildung1 Der lineare Bereich des QIAamp DSP Virus Verfahrens bei einem Elutionsvolumen von 60 µl wurde mittels TaqMan assays zum Nachweis von A HIV-RNA und B HBV-DNA bestimmt. Handbuch für den QIAamp DSP Virus Kit 11/2007 9

10 _DE :17 Uhr Seite 10 Linearer Bereich des QIAamp DSP Virus Verfahrens ermittelt über COBAS AMPLICOR MONITOR Tests A log result IU/ml y = x R 2 = log input IU/ml B log result IU/ml y = x R 2 = log input IU/ml Abbildung 2 Der lineare Bereich des QIAamp DSP Virus Verfahrens bei einem Elutionsvolumen von 60 µl wurde mittels COBAS AMPLICOR MONITOR Tests zum Nachweis von A HIV-RNA und B HBV-DNA bestimmt. Das Verfahren ist für Plasma oder Serum geeignet, dem Citrat oder EDTA als Antikoagulans zugesetzt wurde. Es können frische, lyophilisierte oder gefrorene Proben verwendet werden, die jedoch nicht mehr als einmal eingefroren und aufgetaut werden sollten. Das Verfahren kann zur Isolierung viraler RNA und DNA aus den verschiedensten RNA- und DNA-Viren angewendet werden. Das Verfahren ist so konzipiert, dass Kreuzkontaminationen zwischen einzelnen Proben vermieden werden und potenziell infektiöses Probenmaterial sicher gehandhabt werden kann. Das Verfahren ist ideal geeignet, um eine Vielzahl von Proben parallel zu verarbeiten. Virale Nukleinsäuren werden in Elutionspuffer (AVE) eluiert und können direkt in Amplifikationsreaktionen eingesetzt oder bei 20 C gelagert werden. Prinzip und Verfahren Das QIAamp DSP Virus Verfahren besteht aus 4 Schritten: Lyse der Viruspartikel in der Probe Bindung der viralen Nukleinsäuren im Lysat an die Membran einer QIAamp MinElute Säule Waschen der Membran Elution der viralen Nukleinsäuren von der Membran Das Verfahren wird mit QIAamp MinElute Säulen und einer Vakuumkammer durchgeführt. 10 Handbuch für den QIAamp DSP Virus Kit 11/2007

11 _DE :17 Uhr Seite 11 Probenvolumen Gemäß den ICH-Richtlinien 2QA und 2QB wurden die Nachweisgrenze (DL) und die Quantifizierungsgrenze (QL) des QIAamp DSP Virus Verfahrens (mit einem Ausgangsvolumen der Proben von je 500 µl und Elutionsvolumina von 20 µl und 60 µl) mit verschiedenen diagnostischen Tests bestimmt (Tabelle 2 und 3). Tabelle 2. Nachweisgrenze des QIAamp DSP Virus Verfahrens Nachfolgender Test Elutionsvolumen 95% cut off artus RealArt HBV DNA 20 µl 2,31 IU/ml (n=240) artus RealArt HCV RNA 20 µl 24,.31 IU/ml (n=192) AMPLICOR manual HIV RNA 60 µl 90,92 IU/ml (n=209) TaqMan HBV DNA 60 µl 4,73 IU/ml (n=192) * Nachweisgrenze, bei der 95% der Proben noch positif sind. Tabelle 3. Quantifizierungsgrenze des QIAamp DSP Virus Verfahrens Nachfolgender Test QL CV (Variationskoeffizient) TaqMan HBV DNA 5,7 IU/ml < 70% (n=88) TaqMan HIV RNA 52 IU/ml < 60% (n=88) COBAS AMPLICOR HIV RNA 100 IU/ml < 60% (n=88) COBAS AMPLICOR HBV DNA 30 IU/ml < 60% (n=88) COBAS AMPLICOR HCV RNA 700 IU/ml < 60% (n=66) Lyse der Viruspartikel Die Proben werden unter denaturierenden Bedingungen bei erhöhter Temperatur lysiert. Die Lyse erfolgt in Gegenwart der QIAGEN Protease (QP) und des Lysepuffers (AL), die zusammen die Inaktivierung der RNasen gewährleisten. Handbuch für den QIAamp DSP Virus Kit 11/

12 _DE :17 Uhr Seite 12 Adsorption der Nukleinsäuren an die Membran der QIAamp MinElute Säule Um eine optimale Adsorption der viralen DNA und RNA an die Membran einer QIAamp MinElute Säule zu gewährleisten, werden die Lysate zuerst mit Ethanol versetzt. Jedes Lysat wird dann auf eine QIAamp MinElute Säule aufgetragen und mittels Unterdruck durch die Silicagel-Membran gesaugt, wobei die viralen Nukleinsäuren an die Membran adsorbiert werden. Entfernen verbliebener Kontaminationen Verbleibende Verunreinigungen werden zuerst mit Waschpuffer 1 (AW1), dann mit Waschpuffer 2 (AW2) und schließlich mit Ethanol wirksam entfernt, ohne die Bindung der viralen Nukleinsäuren an die Membran der QIAamp MinElute Säule zu beeinflussen. Elution reiner Nukleinsäuren Die viralen Nukleinsäuren werden mit Elutionspuffer (AVE) von der QIAamp MinElute Säule eluiert. Die QIAamp MinElute Säulen können ein Elutionsvolumen von 20 µl oder 60 µl aufnehmen. Je nachdem, welcher Test im Anschluss durchgeführt wird, kann das Nukleinsäure- Eluat bis zu 50 % des Reaktionsvolumens enthalten, ohne die nachfolgende Reaktion zu hemmen. 12 Handbuch für den QIAamp DSP Virus Kit 11/2007

13 _DE :17 Uhr Seite 13 Das QIAamp DSP Virus Verfahren Probe Lysieren Lesen Sie das Protokoll (Seite 19) vor Präparationsbeginn sorgfältig durch 75 µl QP, 500 µl Probe und 500 µl AL in ein LT pipettieren 15 s auf Vortex mischen 15 min (±1 min) bei 56 C (±1 C) inkubieren 600 µl Ethanol zugeben 15 s auf Vortex mischen 5 min (±1 min) bei Raumtemperatur (15 25 C) inkubieren Binden Lysat in QIAamp MinElute Säule mit aufgestecktem EXT überführen Vakuum Vakuum Waschen (AW1) EXT vor Anlegen des Vakuums entfernen 600 µl gelösten AW1 zugeben EXT entfernen Vakuum Vakuum Waschen (AW2) Waschen (Ethanol) 750 µl gelösten AW2 zugeben 750 µl Ethanol zugeben Trocken zentrifugieren Eluieren Reine virale Nukleinsäuren QIAamp MinElute Säule in WT setzen 1 min bei rpm zentrifugieren QIAamp MinElute Säule in WT setzen 3 min bei 56 C inkubieren QIAamp MinElute Säule in ET setzen 20 µl oder 60 µl AVE zugeben 3 min bei Raumtemperatur (15 25 C) inkubieren 1 min bei rpm zentrifugieren Handbuch für den QIAamp DSP Virus Kit 11/

14 _DE :17 Uhr Seite 14 Vom Anwender bereitzustellende Ausrüstung und Reagenzien Tragen Sie beim Umgang mit Chemikalien immer einen Laborkittel, Schutzhandschuhe und eine Schutzbrille. Weitere Informationen können Sie den entsprechenden Sicherheits-Datenblättern entnehmen, die vom Produktlieferanten erhältlich sind. Ethanol ( %) Pipetten* und Pipettenspitzen (zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen empfehlen wir die Verwendung von Pipettenspitzen mit Aerosolbarriere) Einmal-Laborhandschuhe Heizblock* zur Lyse der Proben bei 56 C (wir empfehlen den Eppendorf Thermomixer comfort mit einem Thermoblock für 2,0-ml-Mikroreaktionsgefäße ) Mikrozentrifuge* Messzylinder (50 ml) Reagenzglasschüttler (Vortex-Mischer) QIAvac 24 Plus Vakuumsystem (QIAvac 24 Plus, Kat.-Nr , QIAvac Verbindungssystem, Kat.-Nr und Vakuum-Pumpe, Kat.-Nr ) oder ein gleichwertiges universell einsetzbares Labor-Vakuumsystem * Um die sachgemäße Verarbeitung der Proben im Rahmen des QIAamp DSP Virus Verfahrens zu gewährleisten, empfehlen wir, die Geräte (z. B. Pipetten und Heizblöcke) gemäß den Empfehlungen des jeweiligen Herstellers zu kalibrieren. Dies ist keine vollständige Lieferantenliste; viele wichtige Vertreiber biologischer Artikel sind nicht aufgeführt. Ab Mitte Mai 2004 erhältlich; bitte besuchen Sie 14 Handbuch für den QIAamp DSP Virus Kit 11/2007

15 _DE :17 Uhr Seite 15 Wichtige Hinweise Wichtige Hinweise vor Präparationsbeginn Überprüfen Sie die Kit-Komponenten nach Erhalt des Kits auf Beschädigungen. Bei Beschädigungen der Blisterpackungen oder der Pufferflaschen wenden Sie sich an den Technischen Service von QIAGEN oder Ihren Lieferanten. Im Falle von ausgelaufener Flüssigkeit lesen Sie unter Sicherheitsinformationen (Seite 7) nach. Verwenden Sie keine beschädigten Kit-Komponenten, da die Leistungsfähigkeit des Kits dadurch beeinträchtigt werden könnte. Verwenden Sie stets RNase-freie Geräte und Materialien. Lagern Sie Ethanol ( %) während des Verfahrens auf Eis. Wechseln Sie nach jedem Pipettierschritt die Pipettenspitzen. Als Schutz vor Kreuzkontaminationen empfehlen wir die Verwendung von Pipettenspitzen mit Aerosolbarriere. Sämtliche Zentrifugationsschritte werden bei Raumtemperatur (15 25 C) durchgeführt. Tragen Sie stets Einmalhandschuhe und überprüfen Sie regelmäßig, ob sie nicht mit Probenmaterial kontaminiert sind. Entsorgen Sie die Handschuhe, falls sie kontaminiert werden, und spätestens bei allen Schritten, die mit dem Handschuh-Symbol gekennzeichnet sind. Öffnen Sie immer nur ein Gefäß, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. Kombinieren Sie nicht die Komponenten verschiedener Kits miteinander, es sei denn, die Chargennummern sind identisch. Vermeiden Sie eine mikrobielle Kontamination der Kit-Reagenzien. Zum Schutz vor Infektionen beim Umgang mit potenziell infektiösem Material empfehlen wir, bis zur Lyse der Proben unter einer Sterilbank zu arbeiten. Dieser Kit sollte nur von Personal verwendet werden, das in Verfahren der In-vitro- Labordiagnostik geschult ist. Die Verfahrensanweisungen beziehen sich auf die Verarbeitung einer einzelnen Plasma- oder Serumprobe. Im QIAvac 24 Plus-Vakuumsystem können jedoch bis zu 24 Proben gleichzeitig verarbeitet werden. Handbuch für den QIAamp DSP Virus Kit 11/

16 _DE :17 Uhr Seite 16 Präparation der RNA Während der Präparation von viraler RNA sollte bei den manuell durchzuführenden Verfahrensschritten zügig gearbeitet werden. Der Elutionspuffer (AVE) enthält Natriumazid*, das eine antimikrobielle Wirkung aufweist und das Wachstum RNase-produzierender Mikroorganismen verhindert. Der Puffer enthält jedoch keine RNase-abbauenden Substanzen, sodass RNasen, die durch unsachgemäße Handhabung eingebracht werden, nicht aktiv gehemmt werden. Beim Umgang mit Elutionspuffer (AVE) ist daher äußerste Sorgfalt geboten, um eine Kontamination mit RNasen zu vermeiden. Lagerung der Proben Nach Entnahme und Zentrifugation kann Plasma oder Serum bei 2 8 C bis zu 6 Stunden aufbewahrt werden. Zur längeren Lagerung empfiehlt es sich, die Probe aliquotiert bei 20 C oder 80 C einzufrieren. Eingefrorene Plasma- oder Serumproben dürfen nicht mehr als einmal aufgetaut werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen führt zu einer Denaturierung und Ausfällung von Proteinen, was einen niedrigeren Virustiter und daher eine geringere Ausbeute an viralen Nukleinsäuren zur Folge haben kann. Darüber hinaus können sich durch Einfrieren und Auftauen Kryopräzipitate bilden, die zu einer Verstopfung der Membran der QIAamp MinElute Säule führen können. Wenn Kryopräzipitate sichtbar sind, können Sie diese durch 3-minütige Zentrifugation bei etwa 6800 x g sedimentieren. Entnehmen Sie den klaren Überstand, ohne das Pellet aufzuwirbeln, und verarbeiten Sie ihn umgehend. Vorbereitung der Reagenzien und Puffer Vorbereitung der QIAGEN Protease Geben Sie den gesamten Inhalt des Röhrchens mit 4,4 ml Protease-Lösungsmittel (Protease Solvent, PS) in das Fläschchen mit der lyophilisierten QIAGEN Protease (QP) und mischen Sie die Lösung sorgfältig. Drehen Sie das Fläschchen dazu mehrmals um, um Schaumbildung zu vermeiden. Vergewissern Sie sich, dass die QIAGEN Protease (QP) vollständig gelöst ist. i Geben Sie die QIAGEN Protease (QP) nicht direkt in den Lysepuffer (AL). Zugabe von Carrier-RNA und interner Kontrolle zum Lysepuffer Die Carrier-RNA wird aus zwei Gründen verwendet: Erstens verstärkt sie die Bindung der viralen Nukleinsäuren an die Membran einer QIAamp MinElute Säule, insbesondere wenn die Probe nur wenige Zielmoleküle enthält. Zweitens wird für den seltenen Fall, dass einzelne RNase-Moleküle durch die choatropen Salze und das Detergens im Lysepuffer (AL) nicht denaturiert werden, durch die Anwesenheit einer * Tragen Sie beim Umgang mit Chemikalien immer einen Laborkittel, Schutzhandschuhe und eine Schutzbrille. 16 Handbuch für den QIAamp DSP Virus Kit 11/2007

17 _DE :17 Uhr Seite 17 relativ großen Menge an Carrier-RNA der Abbau der viralen RNA verhindert. Es kann daher zu einer verminderten Ausbeute an viraler RNA oder DNA kommen, wenn der Lysepuffer (AL) nicht mit Carrier-RNA versetzt wird. Carrier-RNA ist auch in einigen internen Kontrollreagenzien kommerziell erhältlicher Tests enthalten. Beachten Sie in diesen Fällen bitte die entsprechenden Gebrauchsanweisungen des Testherstellers. Bei der Verwendung des QIAamp DSP Virus Kits in Verbindung mit diagnostischen Amplifikationssystemen ist die Mitführung einer internen Kontrolle zu empfehlen. Die interne Kontroll-RNA oder -DNA und die gelöste Carrier-RNA sollten zum Lysepuffer (AL) gegeben und durch 10-maliges Umdrehen des Gefäßes gründlich gemischt werden. Verwenden Sie zum Mischen keinen Reagenzglasschüttler (Vortex), weil die Lösung sonst schäumt. Beachten Sie die jeweiligen Herstellerangaben bei der Bestimmung der optimalen Konzentration der internen Kontrolle. Andere als die vom Hersteller empfohlenen Konzentrationen können zu falschen Ergebnissen führen. Berücksichtigen Sie bei der Berechnung der korrekten Menge an interner Kontrolle das Ausgangsvolumen der Probe und das Elutionsvolumen. Beachten Sie, dass das Ausgangsvolumen der Probe beim QIAamp DSP Virus Kit 500 µl beträgt. Um die Carrier-RNA-Lösung zuzubereiten, geben Sie 310 µl Elutionspuffer (AVE) in das Gefäß mit 310 µl lyophilisierter Carrier-RNA, und stellen Sie eine Lösung mit einer Konzentration von 1 µg/µl her. Lösen Sie die Carrier-RNA gründlich auf, teilen Sie sie in gebrauchsfertige Aliquote auf und lagern Sie diese bei 20 C. Die Carrier-RNA- Aliquote dürfen nicht mehr als zweimal eingefroren und aufgetaut werden. Beachten Sie bitte, dass Carrier-RNA in Lysepuffer (AL) nicht löslich ist. Sie muss zuerst in Elutionspuffer (AVE) gelöst und dann zum Lysepuffer (AL) zugegeben werden. Vergewissern Sie sich, dass die Carrier-RNA in der korrekten Menge Elutionspuffer (AVE) vollständig gelöst ist, bevor Sie sie mit dem Lysepuffer (AL) mischen. i Führen Sie stets die korrekte interne Kontrolle für den nachfolgenden Test mit. Weitere Informationen dazu entnehmen Sie bitten den Anweisungen des jeweiligen Herstellers. Wählen Sie zur Berechnung des Volumens an Lysepuffer-(AL-)/Carrier-RNA-Lösung, das für die Probenverarbeitung benötigt wird, die Anzahl der parallel zu verarbeitenden Proben aus Tabelle 3 aus (Seite 16). Das Volumen wird mit folgender Formel berechnet: n x 0,55 ml = y ml y ml x 11,2 µl/ml = z µl wobei: n = Anzahl der parallel zu verarbeitenden Proben y = berechnetes Volumen an Lysepuffer (AL) z = Volumen an Carrier-RNA/Elutionspuffer (AVE), das zum Lysepuffer (AL) zu geben ist Handbuch für den QIAamp DSP Virus Kit 11/

18 _DE :17 Uhr Seite 18 Tabelle 3. Volumina an Lysepuffer (AL) und Carrier-RNA/Elutionspuffer (AVE), die für das QIAamp DSP Virus Verfahren benötigt werden Anz. Proben Vol. AL (ml) Vol. Carrier- Anz. Proben Vol. AL (ml) Vol. Carrier- RNA/AVE (µl) RNA/AVE (µl) 1 0,55 6,2 13 7,15 80,0 2 1,10 12,3 14 7,70 86,0 3 1,65 18,5 15 8,25 92,4 4 2,20 24,6 16 8,80 98,6 5 2,75 30,8 17 9,35 104,7 6 3,30 37,0 18 9,90 110,9 7 3,85 43, ,45 117,0 8 4,40 49, ,00 123,2 9 4,95 55, ,55 129,4 10 5,50 61, ,10 135,5 11 6,05 67, ,65 141,7 12 6,60 73, ,20 147,8 Vorbereitung von Waschpuffer 1 Geben Sie mit Hilfe eines Messzylinders 25 ml Ethanol ( %) in die Flasche mit 19 ml Waschpuffer-1-(AW1-)Konzentrat. Lagern Sie den gelösten Waschpuffer 1 (AW1) bei Raumtemperatur (15 25 C). i Mischen Sie den gelösten Waschpuffer 1 (AW1) stets vor Präparationsbeginn durch mehrmaliges Umdrehen der Flasche. Vorbereitung von Waschpuffer 2 Geben Sie mit Hilfe eines Messzylinders 30 ml Ethanol ( %) in die Flasche mit 13 ml Waschpuffer-2-(AW2-)Konzentrat. Lagern Sie den gelösten Waschpuffer 2 (AW2) bei Raumtemperatur (15 25 C). i Mischen Sie den gelösten Waschpuffer 2 (AW2) stets vor Präparationsbeginn durch mehrmaliges Umdrehen der Flasche. Vorbereitung des Elutionspuffers Im Lieferungsumfang des Kits sind vier Gefäße mit Elutionspuffer (AVE) enthalten. Vermeiden Sie jegliche Verunreinigung des Puffers mit RNasen. Bei Durchführung von bis zu 4 Reinigungsverfahren mit einem einzelnen Kit empfehlen wir, das Gefäß mit Elutionspuffer (AVE) nach Abschluss jedes Verfahrens zu verwerfen. 18 Handbuch für den QIAamp DSP Virus Kit 11/2007

19 _DE :17 Uhr Seite 19 Elution der viralen Nukleinsäuren Bei nachfolgenden Anwendungen, in die nur ein geringes Ausgangsvolumen eingesetzt werden kann (z. B. bei einigen PCR- und RT-PCR-Assays), lässt sich die Testsensitivität durch Verwendung von in 20 µl Elutionspuffer (AVE) eluierten viralen Nukleinsäuren steigern. Das Volumen der von einer QIAamp MinElute Säule eluierten viralen Nukleinsäuren kann bis zu 5 µl geringer sein als das Elutionspuffervolumen (AVE), das auf die Säule gegeben wurde. Beispiel: Bei der Elution viraler Nukleinsäuren mit 60 µl Elutionspuffer (AVE) erhält man ein Eluat von etwa 55 µl, während die Elution mit 20 µl ein Eluat von etwa 15 µl ergibt. Das Eluatvolumen hängt von der Art der Probe ab. Wenn das Eluatvolumen für den nachfolgenden Test nicht ausreicht, erhöhen Sie das Volumen durch Zugabe einer größeren Menge Elutionspuffer (AVE). Die eluierten viralen Nukleinsäuren werden in Elutionsgefäßen (ET) gesammelt. Zur Aufbewahrung der viralen Nukleinsäuren für bis zu 24 Stunden empfehlen wir eine Lagerung bei 2 8 C. Ausbeute und Qualität viraler Nukleinsäuren Die Ausbeute und die Qualität der isolierten viralen Nukleinsäuren sind für molekulardiagnostische Nachweisverfahren jeglicher Art geeignet. Die diagnostischen Tests sollten gemäß den Angaben des jeweiligen Herstellers durchgeführt werden. Vorbereitung des QIAvac 24 Plus Vakuumsystems Vergewissern Sie sich, dass Sie den Column Extender (EXT, Verlängerungsadapter), die QIAamp MinElute Säule, den VacConnector (VC) und das VacValve Vakuumventil richtig zusammensetzen (siehe Abbildung 3) Abbildung 3 Zusammensetzen der Komponenten des QIAamp DSP Virus Kits zur Verarbeitung von Proben in einem Vakuumsystem: 1: VacValve Vakuumventil (im Lieferumfang des Vakuumsystems enthalten) 3: QIAamp MinElute Säule 2: VacConnector 4: Column Extender Verlängerungsadapter (EXT) Handbuch für den QIAamp DSP Virus Kit 11/

20 _DE :17 Uhr Seite 20 Um eine Verwechslung der Proben zu vermeiden, empfehlen wir, die Lyse-Tubes (LT), Elutions-Tubes (ET) und QIAamp MinElute Säulen für den Gebrauch auf dem QIAvac 24 Plus Vakuumsystem gemäß dem Schema in Abbildung 4 zu beschriften. Diese Abbildung kann fotokopiert und mit den Namen der Proben beschriftet werden Handbuch für den QIAamp DSP Virus Kit 11/2007

21 _DE :17 Uhr Seite 21 Datum: Anwender: Präparations-ID: Abbildung 4 Beschriftungsschema für Lyse-Tubes (LT), Elutions-Tubes) und QIAamp MinElute Säulen zur Verwendung auf einem QIAvac 24 Plus Vakuumsystem. Handbuch für den QIAamp DSP Virus Kit 11/

22 _DE :17 Uhr Seite 22 Protokoll Protokoll: Isolierung und Reinigung viraler Nukleinsäuren aus Plasma und Serum Zur Isolierung und Reinigung viraler Nukleinsäuren aus 500 µl mit EDTA oder Citrat behandeltem Plasma oder Serum. Arbeiten, die vor Beginn auszuführen sind Äquilibrieren Sie die Proben auf Raumtemperatur (15 25 C) und vergewissern Sie sich, dass sie gut durchmischt sind. Geben Sie in Elutionspuffer (AVE) gelöste Carrier-RNA oder interne Kontrolle zum Lysepuffer (AL) gemäß den Anweisungen auf Seite 14. Vergewissern Sie sich, dass der Waschpuffer 1 (AW1), der Waschpuffer 2 (AW2) und die QIAGEN Protease (QP) gemäß den Anweisungen unter Wichtige Hinweise auf Seite 14 vorbereitet wurden. Äquilibrieren Sie den Elutionspuffer (AVE) auf Raumtemperatur (15 25 C) zur Verwendung in Schritt 18. Verwenden Sie nach Möglichkeit für jedes Verfahren frischen Elutionspuffer (AVE) (im Kit sind vier Röhrchen enthalten). Temperieren Sie für Schritt 4 und 17 einen Heizblock auf 56 C. Stecken Sie als Schutz vor Kreuzkontaminationen einen VacConnector (VC) auf jeden Luer-Adapter des Vakuumsystems. Vergewissern Sie sich, dass die Abfallflasche des Vakuumsystems leer ist und alle Verbindungsstücke richtig angeschlossen sind. Einzelheiten zur Bedienung des Vakuumsystems, insbesondere zur Wartung, entnehmen Sie bitte dem Handbuch des jeweiligen Systems. Verfahren 1. Pipettieren Sie 75 µl QIAGEN Protease (QP) in einen Lyse-Tube (LT). i Überprüfen Sie vor Gebrauch das Verfallsdatum der gelösten Protease. 2. Geben Sie 500 µl Plasma oder Serum in den Lyse-Tube (LT). 3. Geben Sie 500 µl Lysepuffer (AL) (der 11,2 µg/ml Carrier-RNA enthält) in den Lyse-Tube (LT), schließen Sie den Deckel und mischen Sie 15 s auf einem Reagenzglasschüttler (Vortex). Für eine effiziente Lyse ist es besonders wichtig, Probe und Lysepuffer (AL) gründlich zu mischen, bis eine homogene Lösung entstanden ist. i Der Lysepuffer (AL) enthält interne Kontrolle. Achten Sie wegen der hohen Viskosität des Lysepuffers (AL) besonders auf eine korrekte Dosierung des Lysepuffers (AL), indem Sie sorgfältig pipettieren oder eine geeignete Pipette, z. B. eine Eppendorf Multipette oder eine gleichwertige Pipette, verwenden. i Geben Sie die QIAGEN Protease (QP) nicht direkt in den Lysepuffer (AL). 22 Handbuch für den QIAamp DSP Virus Kit 11/2007

23 _DE :17 Uhr Seite Inkubieren Sie 15 min (±1 min) bei 56 C (±1 C). 5. Zentrifugieren Sie den Lyse-Tube (LT) 5 s bei maximaler Drehzahl, um die Tröpfchen auf der Innenseite des Deckels wieder mit dem Rest der Flüssigkeit zu vereinigen. 6. Wechseln Sie die Handschuhe und öffnen Sie vorsichtig den Lyse-Tube (LT). 7. Geben Sie 600 µl Ethanol ( %) in den Lyse-Tube (LT), schließen Sie den Decke und mischen Sie die Lösung für 5 s gründlich auf einem Vortex. Inkubieren Sie 5 min (±1 min) bei Raumtemperatur (15 25 C). 8. Zentrifugieren Sie den Lyse-Tube (LT) 5 s bei maximaler Drehzahl, um die Tröpfchen auf der Innenseite des Deckels wieder mit dem Rest der Flüssigkeit zu vereinigen. 9. Stecken Sie die QIAamp MinElute Säule auf einen VacConnector (VC) auf dem Vakuumsystem (siehe Abbildung 3, Seite 19). Stecken Sie einen Column Extender (EXT) auf die offene QIAamp MinElute Säule. Protokoll i Heben Sie den Wasch-Tube (WT) für Schritt 16 auf (Zentrifugation zur Trocknung der Membran). 10. Wechseln Sie die Handschuhe und öffnen Sie immer nur ein Gefäß. 11. Geben Sie das gesamte Lysat aus Schritt 7 vorsichtig in den Column Extender (EXT) der QIAamp MinElute Säule, ohne den oberen Rand zu benetzen. Vermeiden Sie es, die Membran der QIAamp MinElute Säule mit der Pipettenspitze zu berühren. 12. Schalten Sie die Vakuumpumpe ein. Wenn das Lysat vollständig durch die Membran der QIAamp MinElute Säule gelaufen ist, öffnen Sie das Ventil des Vakuumsystems, um das Vakuum aufzuheben. Bei der gleichzeitigen Verarbeitung mehrerer QIAamp MinElute Säulen empfehlen wir, das VacValve-Ventil jeder Säule nach Durchlauf des Lysats zu schließen, um die Dauer dieses Vakuumschritts zu verkürzen. i Wenn das Lysat nach 15 min nicht vollständig durch die Membran gelaufen ist, verwerfen Sie die QIAamp MinElute Säule und wiederholen Sie das Verfahren mit einer neuen Probe. i Das Vakuumsystem muss so geöffnet werden, dass der Vakuumdruck rasch aufgehoben wird. 13. Geben Sie 600 µl Waschpuffer 1 (AW1) auf die QIAamp MinElute Säule. Entfernen Sie vorsichtig den Column Extender (EXT) und verwerfen Sie ihn; schließen Sie das Ventil des Vakuumsystems. Wenn der Waschpuffer 1 (AW1) vollständig durch die Membran der QIAamp MinElute Säule gelaufen ist, öffnen Sie das Ventil, um das Vakuum aufzuheben. i Um Kreuzkontaminationen zu vermeiden, sollten die entfernten Column Extenders (EXT) nicht über die benachbarten QIAamp MinElute Säulen gereicht werden. Handbuch für den QIAamp DSP Virus Kit 11/

24 _DE :17 Uhr Seite 24 Protokoll 14. Geben Sie 750 µl Waschpuffer 2 (AW2) auf die QIAamp MinElute Säule, ohne den oberen Rand zu benetzen. Vermeiden Sie es, die Membran der QIAamp MinElute Säule mit der Pipettenspitze zu berühren. Lassen Sie den Deckel der Säule geöffnet und schließen Sie das Ventil des Vakuumsystems. Wenn der Waschpuffer 2 (AW2) vollständig durch die Membran der QIAamp MinElute Säule gelaufen ist, öffnen Sie das Ventil, um das Vakuum aufzuheben. 15. Geben Sie 750 µl Ethanol ( %) auf die QIAamp MinElute Säule, ohne den oberen Rand zu benetzen. Vermeiden Sie es, die Membran der QIAamp MinElute Säule mit der Pipettenspitze zu berühren. Lassen Sie den Deckel der Säule geöffnet und schließen Sie das Ventil des Vakuumsystems. Wenn das Ethanol vollständig durch die Membran der QIAamp MinElute Säule gelaufen ist, öffnen Sie das Ventil, um das Vakuum aufzuheben. i Verwenden Sie zur Pipettierung von Ethanol auf die QIAamp MinElute Säule Pipettenspitzen mit Aerosolbarriere. 16. Schließen Sie den Deckel der QIAamp MinElute Säule, entfernen Sie diese vom Vakuumsystem und verwerfen Sie den VacConnector (VC). Setzen Sie die QIAamp MinElute Säule in den in Schritt 9 reservierten Wasch-Tube (WT) und zentrifugieren Sie 1 min bei maximaler Drehzahl (etwa x g bzw rpm), um die Membran vollständig zu trocknen. Verwerfen Sie den benutzten Wasch-Tube (WT) mitsamt Filtrat. i Das Auslassen des Zentrifugationsschritts zur Membrantrocknung kann zu einer Beeinträchtigung des nachfolgenden Tests führen. 17. Setzen Sie die QIAamp MinElute Säule in einen neuen Wasch-Tube (WT) und inkubieren Sie bei geöffnetem Deckel 3 min bei 56 C, um die eventuell vorhandene Restflüssigkeit zu verdampfen. 18. Setzen Sie die QIAamp MinElute Säule in einen sauberesn Elutions-Tube (ET) und verwerfen Sie den benutzten Wasch-Tube (WT) mitsamt Filtrat. Öffnen Sie vorsichtig den Deckel der QIAamp MinElute Säule und geben Sie 20 µl oder 60 µl Elutionspuffer (AVE) (je nach nachfolgendem Test) auf die Mitte der Membran. Schließen Sie den Deckel und inkubieren Sie 3 min (± 30 s) bei Raumtemperatur (15 25 C). Zentrifugieren Sie 1 min bei maximaler Drehzahl (etwa x g bzw rpm), um die viralen Nukleinsäuren zu eluieren. i Führen Sie im Anschluss an dieses Protokoll das Wartungsverfahren für das Vakuumsystem durch (weitere Einzelheiten dazu entnehmen Sie bitte dem Handbuch des Vakuumsystems). 24 Handbuch für den QIAamp DSP Virus Kit 11/2007

25 _DE :17 Uhr Seite 25 Notizen Handbuch für den QIAamp DSP Virus Kit 11/

26 _DE :17 Uhr Seite 26 Notizen 26 Handbuch für den QIAamp DSP Virus Kit 11/2007

27 _DE :17 Uhr Seite 27 Notizen Handbuch für den QIAamp DSP Virus Kit 11/

28 _DE :17 Uhr Seite 28 Australia Orders Fax Technical Austria Orders 0800/ Fax 0800/ Technical 0800/ Belgium Orders Fax Technical Canada Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) China Orders Fax Technical Denmark Orders Fax Technical Finland Orders Fax Technical France Orders Fax Technical Offers Germany Orders Fax Technical Hong Kong Orders Fax Technical Ireland Orders Fax Technical Italy Orders Fax Technical Japan Telephone Fax Technical Korea (South) Orders Fax Technical Luxembourg Orders Fax Technical The Netherlands Orders Fax Technical Norway Orders Fax Technical Singapore Orders Fax Technical Sweden Orders Fax Technical Switzerland Orders Fax Technical UK Orders Fax Technical USA Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) DE 11/2007 Sample & Assay Technologies