peqgold RNAPure Optimierte Guanidinisothiocyanat/Phenol-Methode für die Extraktion von RNA.

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1 peqgold RNAPure Optimierte Guanidinisothiocyanat/Phenol-Methode für die Extraktion von RNA. Lot-Nr. Best.-Nr ml ml ml Lagerung: Lichtgeschützt bei 4 C für 12 Monate haltbar. Beschreibung: peqgold RNAPure ist ein gebrauchsfertiges Reagenz für die Extraktion von RNA aus Materialien humanen, tierischen, pflanzlichen, bakteriellen und viralen Ursprungs. Die Methode basiert auf einer besonders zeitsparenden Einschritt-Flüssigphasen-Separation. Mit ihrer Hilfe erhält man nichtdegradierte RNAs sowohl aus kleinen als auch aus großen Probenmengen. peqgold RNAPure ermöglicht auch die gleichzeitige Bearbeitung großer Probenzahlen. peqgold RNAPure enthält Phenol und Guanidinisothiocyanat in einphasiger Lösung. Nach der Zugabe von Chloroform und anschließender Zentrifugation trennt sich das Homogenat in drei Phasen auf. Die RNA ist in der wäßrigen Phase enthalten. Die Extraktion mit peqgold RNAPure ergibt qualitativ und quantitativ sehr gute Ausbeuten. Extrakte zahlreicher Zellsorten beinhalten in der endgültigen RNA-Fraktion noch Material unbekannter Zusammensetzung mit einem hohen Polysaccharidanteil. Dieses Material ist in wäßrigen Guanidinisothiocyanatlösungen und Wasser löslich sowie in Alkohol unlöslich. Es bildet DNA-ähnliche Fäden und hat eine den Nukleinsäuren vergleichbare UV-Absorption. Dadurch führt es zu falschen Berechnungen des RNA-Gehaltes, was bei Hybridisierungen und Enzymreaktionen zu Problemen führen kann. Darüber hinaus verschlechtert es die RNA-Qualität und hat inhibitorische Effekte auf RT- PCRs. Zellen verschiedener Entwicklungsstadien enthalten unterschiedliche Mengen dieses kontaminierenden Materials. Die einfache Erweiterung der peqgold RNAPure -Methode durch eine anschließende peqgold OptiPure -Reinigung entfernt derartige Verunreinigungen. Warnung: peqgold RNAPure enthält die gesundheitsschädlichen Stoffe Phenol und Guanidinisothiocyanat. Das Arbeiten mit peqgold RNAPure darf nur mit Handschuhen und Schutzbrille unter einem Abzug erfolgen. Sollte es dennoch zu einem Kontakt von peqgold RNA- Pure mit der Haut oder den Augen kommen, sind die betroffenen Stellen für mindestens 15 Minuten unter fließendem Wasser zu waschen. Begeben Sie sich anschließend umgehend in ärztliche Behandlung. Dieses Produkt ist ausschließlich für Forschungszwecke geeignet. Eine Verwendung für diagnostische Zwecke oder als Arzneimittel sowie eine Verabreichung an Menschen oder Tiere ist nicht gestattet. PEQLAB_v0815_D 1

2 Gefährliche Inhaltsstoffe Bestandteile Signalwort / Symbole Gefährliche Inhaltsstoffe H- und P-Sätze RNAPure DANGER Phenol 30-60%, Guanidinium thiocyanate 10-30%, 2- Mercaptoethanol <1%, CAS: , , H341, H301+H311+H331, H373, H314, H412, EUH032, P201, P280, P273, P301+P330+P331, P302+P352, P304+P340, P307+P310 H- und P-Sätze Erläuterungen H341 Kann vermutlich genetische Defekte verursachen (Expositionsweg angeben, sofern schlüssig belegt ist, dass diese Gefahr bei keinem anderen Expositionsweg besteht). H301+H311+H331 Giftig bei Verschlucken, Hautkontakt oder Einatmen. H373 Kann die Organe schädigen (alle betroffenen Organe nennen) bei längerer oder wiederholter Exposition (Expositionsweg angeben, wenn schlüssig belegt ist, dass diese Gefahr bei keinem anderen Expositionsweg besteht). H314 Verursacht schwere Verätzungen der Haut und schwere Augenschäden. H412 EUH032 P201 P280 P273 P301+P330+P331 P302+P352 P304+P340 P307+P310 Anleitung für die RNA-Extraktion Schädlich für Wasserorganismen, mit langfristiger Wirkung. Entwickelt bei Berührung mit Säure sehr giftige Gase. Vor Gebrauch besondere Anweisungen einholen. Schutzhandschuhe/Schutzkleidung/Augenschutz/Gesichtsschut z tragen. Freisetzung in die Umwelt vermeiden. BEI VERSCHLUCKEN: Mund ausspülen. KEIN Erbrechen herbeiführen. BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT: Mit viel Wasser/ waschen. BEI EINATMEN: Die Person an die frische Luft bringen und für ungehinderte Atmung sorgen. Bei Exposition: Sofort Giftinformationszentrum oder Arzt anrufen RNA-Extraktionen mit peqgold RNAPure können in 1 Stunde ausgeführt werden. RNA, die dabei extrahiert wird, ist nicht degradiert und frei von DNA und Proteinen. Sie kann für folgende Verfahren weiterverwendet werden: Northern-Analysen, cdna-synthesen, RT-PCR-Reaktionen, Dot-Blot-Hybridisierungen, Poly(A) + -Selektionen, in vitro-translationen, Klonierungen und RNase-Assays. PEQLAB_v0815_D 2

3 Benötigte Reagenzien, die nicht mitgeliefert werden: Chloroform Isopropanol Ethanol hochwertige Polypropylen-Zentrifugenröhrchen (Zentrifugation mit Phenol bei x g!!!) Das Verfahren besteht aus folgenden Schritten: 1. Homogenisierung 2.0 ml peqgold RNAPure mg Probe 2. Phasentrennung Homogenat ml Chloroform 3. RNA-Präzipitation wäßrige Phase ml Isopropanol 4. Waschen der RNA 1 ml 75 %iges Ethanol 5. Lösen der RNA Formamid, 0.5 % SDS oder Wasser Wenn nicht anders angegeben, wird die Extraktion bei Raumtemperatur durchgeführt. 1. Homogenisierung a. Gewebe 100 mg Gewebe werden mit je 2 ml peqgold RNAPure homogenisiert. Um eine gute Lyse zu erreichen, sollte ein Glas-, ein Teflon- oder ein elektrischer Homogenisator verwendet werden. Das Probenvolumen sollte nicht mehr als 10 % des verwendeten peqgold RNAPure -Volumens betragen. b. Monolayer-Zellen Die Zellen werden direkt in der Zellkulturschale durch die Zugabe von 1 ml peqgold RNA- Pure pro 3.5-cm-Schale und durch mehrmaliges Aufziehen mit der Pipette lysiert. Die Menge an benötigtem peqgold RNAPure ist nicht von der Zellzahl, sondern von der Größe der Zellkulturschale (in der Regel 1 ml pro 10 cm 2 ) abhängig. Eine unzureichende Menge an peqgold RNAPure kann zur Kontamination der extrahierten RNA mit DNA führen. c. Zellsuspensionen Zellsuspension zentrifugieren und mit 1 ml peqgold RNAPure pro 5-10 x 10 6 Zellen (Tier-, Pflanzen-, Hefe- oder Bakterienzellen) resuspendieren. Waschen der Zellen vor der Lyse fördert den Abbau der RNA und sollte vermieden werden. Bei der Extraktion von RNA aus Hefen und Bakterien ist in einigen Fällen eine zusätzliche Homogenisierung notwendig. 2. Phasentrennung Die Proben für 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen, um die Dissoziation der Nukleotidkomplexe zu gewährleisten. Je eingesetztem Milliliter peqgold RNAPure 0.2 ml Chloroform zugeben und die Proben für 15 Sekunden kräftig schütteln. Danach 3-10 Minuten auf Eis bzw. bei 4 C stehen lassen. Eine Inkubation bei Raumtemperatur ist ebenfalls möglich, führt aber eventuell zu einer schlechtern Phasentrennung. Anschließende die Probe für 5 Minuten bei x g zentrifugieren (4 C) um eine Phasenauftrennung zu bekommen. Es bilden sich drei Phasen: eine untere gelbe Phenol- Chloroform-Phase, eine obere farblose wäßrige Phase und eine dazwischenliegende Interphase. Die RNA ist ausschließlich in der wäßrigen Phase angereichert, während sich die DNA und die Proteine in der Interphase und der Phenolphase befinden. Die wäßrige Phase nimmt dabei ca. 60 % des Probenvolumens ein. Das verwendete Chloroform sollte von Zusätzen wie z.b. Isoamylalkohol frei sein. PEQLAB_v0815_D 3

4 3. RNA-Präzipitation Die wäßrige Phase in ein frisches Röhrchen überführen. Die Präzipitation der RNA erfolgt mit dem gleichen Volumen an Isopropanol. Proben für 15 Minuten bei 4 C inkubieren und anschließend für 10 Minuten bei x g und 4 C zentrifugieren. Das RNA-Präzipitat sollte von gelartiger Konsistenz sein und an der unteren Seite des Röhrchens liegen. 4. Waschen der RNA Den Überstand vorsichtig abnehmen und das Pellet zweimal mit 1 ml 75 % Ethanol waschen und anschließend zentrifugieren (10 Minuten, x g, 4 C). 5. Lösen der RNA Das RNA-Pellet kurz an der Luft oder durch Anlegen eines leichten Vakuums trocknen lassen. Ein vollständiges Trocknen des Pellets verschlechtert die Löslichkeit der RNA und sollte deshalb vermieden werden. Die RNA nicht durch Vakuumzentrifugation trocknen lassen!!! Die RNA durch mehrmaliges Auf- und Abziehen mit der Pipette in deionisiertem Formamid, RNasefreiem Wasser oder in 0.5 %igem SDS lösen. Ein Erhitzen der RNA-Lösung auf C verbessert die Lösbarkeit. Um eine Kontamination mit RNasen zu verhindern sollten Wasser und SDS-Lösungen, die zum Lösen der RNA eingesetzt werden, vorher mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandelt werden. peqgold RNAPure extrahiert Gesamt-RNA einschließlich mrna und rrna. Die erhaltene Lösung ist frei von DNA und Proteinen und hat einen A 260/280-Quotienten von Anmerkungen 1. Um RNase-Kontaminationen zu vermeiden, sollten während der gesamten Extraktion Handschuhe getragen und ausschließlich RNase-freie Lösungen und Geräte verwendet werden. 2. Erwartet man nur geringe Mengen von RNA (< 10 µg) sollten 70 µg Glykogen pro 1 ml peqgold RNAPure als Carrier für die Präzipitation zugesetzt werden. 3. Nach der Homogenisierung und vor der Zugabe von Chloroform können die Proben einige Monate bei 70 C gelagert werden. Das RNA-Präzipitat kann nach dem Waschen der RNA für 1-3 Wochen bei 4 C in 75 %igem Ethanol oder für 1 Jahr bei 20 C gelagert werden. 4. Für die RNA-Extraktion mit peqgold RNAPure können auch Table-Top-Zentrifugen verwendet werden, wenn sie ein Maximum von x g erreichen. In diesem Fall müssen lediglich die Zentrifugationszeiten in den Schritten 2 und 3 auf Minuten verlängert werden. 5. Bei Verwendung von Proben mit hohem Gehalt an Proteinen, Polysacchariden, Fetten oder anderen Bestandteilen ist ein Extra-Reinigungsschritt ratsam. Vor der Phasentrennung mit Chloroform können unlösliche Bestandteile durch Zentrifugation für 10 Minuten bei x g und 4 C entfernt werden. Der Überstand enthält die RNA, während im Pellet die Polysaccharide, extrazellulären Membranbestandteile und hochmolekularen DNAs lokalisiert sind. Bei Proben aus fettreichem Gewebe kommt es zur Bildung einer schaumartigen Fettschicht, die entfernt werden sollte. Der klare, RNA-haltige Überstand wird in ein neues Röhrchen überführt und die Chloroform-Extraktion durchgeführt wie beschrieben. PEQLAB_v0815_D 4

5 Trouble-Shooting Guide Erwartete RNA-Mengen pro mg Gewebe oder 10 6 Zellen Bauchspeicheldrüse µg Leber und Milz 6-10 µg Niere 3-4 µg Plazenta 1-4 µg Skelettmuskulatur und Gehirn µg Epithelzellen 8-15 µg Fibroblasten 5-7 µg RNA-Menge zu gering: Unvollständige Homogenisierung oder unvollständige Lyse RNA-Pellet nicht vollständig gelöst A 260/280-Quotient < 1.65: Probe wurde in zu geringem Volumen homogenisiert Probe wurde nach der Homogenisierung nicht bei Raumtemperatur inkubiert Die wässrige Phase war mit der Phenolphase kontaminiert RNA-Pellet nicht vollständig gelöst RNA-Abbau: Gewebe wurde nicht direkt zur Extraktion verwendet oder nicht direkt eingefroren Zellen wurden durch Trypsinieren zerstört Kontamination mit RNase während der Präparation Die verwendeten Proben wurden nicht bei 70 C gelagert Bei der Elektrophorese lag der ph-wert der Formaldehydlösung unter 3.5 Verringerung von Scherkräften verbessert das 18S und 28S Verhältnis der isolierten RNA DNA-Kontamination: Probe wurde in zu geringem Volumen homogenisiert Die zur Extraktion verwendeten Proben enthielten organische Lösungen z.b. Ethanol, DMSO, konzentrierte Puffer oder hatten einen alkalischen ph-wert PEQLAB_v0815_D 5