RNA Tri-Flüssig Extraktion

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1 Datenblatt Artikel-Nr. BS Artikel-Nr. BS Artikel-Nr. BS ml 100 ml 5 x 100 ml (Nur für Forschung und in vitro-anwendungen) Chargen-Nr.: Mindestens haltbar bis: Aussehen: Farbe: 1

2 Beschreibung Modifizierte Guanidinisothiocyanat/ Phenol-Methode für die Extraktion von RNA. RNA Tri-Flüssig ist ein Reagenz für die effiziente Isolierung von Total-RNA aus unterschiedlichsten Ausgangsmaterialien (Gewebe, Zellen, Bakterien, Pflanzen, etc.) sowie aus unterschiedlichsten Mengen an Ausgangsmaterialien. Die Extraktionsmethode basiert auf einer besonders zeitsparenden Einschritt-Flüssigphasen-Separation. RNA Tri-Flüssig enthält ein Gemisch aus Phenol und Guanidinisothiocyanat in monophasischer Lösung. Nach der Zugabe von Chloroform und anschließender Zentrifugation trennt sich das Homogenat in drei Phasen auf, einer gefärbten unteren organischen Phase, einer weißlichen Interphase und einer oberen farblosen wässrigen Phase. Die RNA befindet sich in der oberen wässrigen Phase. Aus dieser wässrigen Phase wird die RNA über die Zugabe von Alkohol präzipitiert. Die RNA-Extraktion mit RNA Tri-Flüssig kann in ca. 1 Stunde durchgeführt werden. Die RNA, die dabei extrahiert wird, ist undegradiert und von hoher Qualität. Sie kann für eine Vielzahl von downstream- Applikationen eingesetzt werden, wie Northern-Analysen, cdna-synthese, RT-PCR-Reaktionen, Dot-Blot-Hybridisierungen, Poly(A)+-Selektionen, in vitro-translationen, Klonierungen und RNase-Assays. 2

3 Sicherheitsanweisungen Bitte gehen Sie mit allen Materialien und Reagenzien, die im Kit enthalten sind vorsichtig um. Es sollten immer Handschuhe getragen und Hautkontakt vermieden werden! Bei Kontakt mit Augen oder Haut sofort mit viel Wasser abspülen! Lesen Sie sich bitte jeden Abschnitt sorgfältig durch, um Ihre eigene Sicherheit und eine reibungslose Durchführung zu garantieren. Folgen Sie allen Sicherheitshinweisen wie in dieser Broschüre erklärt, sowie auch Hinweisen und Informationen. Für den einmaligen Gebrauch Verwenden Sie keine Komponente ein zweites Mal! Vorsicht! Trinken oder Essen der Kit-Komponenten sind strikt untersagt! Wenn die Pufferflaschen beschädigt oder undicht sind, tragen Sie bei der Entsorgung der Flaschen Handschuhe und eine Schutzbrille, um Verletzungen zu vermeiden. Dieses Kit kann mit potentiell infektiösen Proben verwendet werden. Daher müssen alle flüssigen Abfälle als potentiell infektiös betrachtet werden und müssen entsprechend der örtlichen Sicherheitsvorschriften behandelt und verworfen werden. Bitte beachten Sie die Bundes-, Landes- und örtlichen Sicherheitsund Umwelt-vorschriften. Befolgen Sie die üblichen Vorsichtsmaßnahmen für die Arbeiten mit extrahierten Nukleinsäuren. Alle Materialien und Reagenzien, die für die DNA- oder RNA-Isolierung verwendet werden, sollten frei von DNasen und RNasen sein. 3

4 Vorsicht! Fügen Sie nach der Probenvorbereitung dem Abfall keine Bleiche oder sauren Bestandteile hinzu. Hinweis: Notfallmedizinische Informationen in englischer und deutscher Sprache können 24 Stunden am Tag erhalten werden. Telefonnummern der Vergiftungs-Informations-Zentralen: München +49 (0) Wien 01/ Zürich (für die Schweiz: 145) Für weitere Informationen fragen Sie bitte das Sicherheitsdatenblatt an. 4

5 Warnung RNA Tri-Flüssig enthält die gesundheitsschädlichen Stoffe Phenol und Guanidinisothiocyanat. Das Arbeiten mit dem Reagenz darf nur mit Handschuhen und Schutzbrille unter einem Abzug erfolgen. Sollte es dennoch zu einem Kontakt der Haut oder den Augen mit dem Reagenz kommen, sind die betroffenen Stellen für mindestens 15 Minuten unter fließendem Wasser zu waschen. Begeben Sie sich anschließend umgehend in ärztliche Behandlung. Dieses Produkt ist ausschließlich für Forschungszwecke geeignet. Eine Verwendung für diagnostische Zwecke oder als Arzneimittel sowie eine Verabreichung an Menschen oder Tieren ist nicht gestattet. 5

6 GHS-Klassifikation Komponente RNA Tri- Flüssig Gefährdender GHS Inhalt Symbol Phenol 25 50% Guanidiniumthiocyanat 10 - < 25% Natrium-Nlauroylsarcosinat 0,1 - < 0,3% Gefahr H-Sätze P-Sätze EUH , 314, 331, 341, , 102, 103, 260, , , 405, H-Sätze Gesundheitsschädlich bei Verschlucken oder Hautkontakt. 314 Verursacht schwere Verätzungen der Haut und schwere Augenschäden. 331 Giftig beim Einatmen. 341 Kann vermutlich genetische Defekte verursachen 373 Kann die Organe schädigen bei längerer oder wiederholter Exposition. 6

7 P-Sätze 101 Ist ärztlicher Rat erforderlich, Verpackung oder Kennzeichnungsetikett bereithalten. 102 Darf nicht in die Hände von Kindern gelangen. 103 Vor Gebrauch Kennzeichnungsetikett lesen. 260 Staub/Rauch/Gas/Nebel/Dampf/Aerosol nicht einatmen. 280 Schutzhandschuhe/Schutzkleidung/Augenschutz/Gesichtsschutz tragen. 405 Unter Verschluss aufbewahren. 501 Inhalt/Behälter gemäß der lokalen/nationalen/internationalen Vorschriften der Entsorgung zuführen BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT (oder dem Haar): Alle kontaminierten Kleidungsstücke sofort ausziehen. Haut mit Wasser abwaschen [oder duschen] BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang behutsam mit Wasser spülen. Eventuell vorhandene Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter spülen. EUH-Sätze 032 Entwickelt bei Berührung mit Säure sehr giftige Gase. 7

8 Sicherheitshinweise zum Umgang mit RNA RNA ist sehr anfällig für Degradierung, nachfolgende Maßnahmen bitte beachten: Während der gesamten Extraktion müssen Handschuhe getragen und ausschließlich RNase-freie Lösungen und Geräte verwendet werden. Handschuhe häufig wechseln und alle Gefäße geschlossen halten. Isolierte RNA stets kühlen und die Präparationsdauer möglichst gering halten. Während der gesamten Präparation nur sterile Einmal-Polypropylengefäße benutzen (diese sind gewöhnlich RNase-frei). Nicht-Einweg-Plastikartikel vor Gebrauch mit 0,1 M NaOH, 1 mm EDTA und nachfolgend mit RNase-freiem Wasser spülen, um RNase-Freiheit sicherzustellen. Chloroform-resistente Plastikartikel können alternativ mit Chloroform gespült werden. Alle Glaswaren sollten vor Gebrauch mit Detergenzien gereinigt, sorgfältig gespült und für mindestens 4 Stunden bei 240 C im Ofen gebacken werden. Autoklavieren allein ist nicht ausreichend zur vollständigen Inaktivierung vieler RNasen. Das Backen im Ofen hingegen stellt zusätzlich zur Inaktivierung der RNasen sicher, dass sich keine anderen Nukleinsäuren (wie z.b. Plasmid- DNA) an der Oberfläche befinden. Alternativ können Glaswaren durch vollständiges Bedecken mit 0,1% DEPC (Diethyl-Pyrocarbonat) für 12 Stunden bei 37 C und nachfolgendes Autoklavieren oder Erhitzen auf 100 C für 15 Minuten zur Entfernung des restlichen DEPC gereinigt werden. Elektrophorese-Kammern mit Detergenzien (z.b. 0,5% SDS) reinigen und anschließend sorgfältig mit RNase-freiem Wasser und nachfolgend mit Ethanol spülen. Trocknen lassen! Alle Puffer und Lösungen mit DEPC-behandeltem RNase-freiem ddh 2 O ansetzen. Den Umgang mit Bakterienkulturen, Zellkulturen oder anderen biologischen Quellen von RNasen im gleichen Labor vermeiden in dem die RNA-Präparation durchgeführt wird. Getrennte Apparate, Glas- und Plastikwaren für die RNA-Isolierung und für Applikationen, bei denen RNasen freigesetzt werden können, verwenden. 8

9 Tipps 1. Erwartet man nur geringe Mengen von RNA (< 10 µg), sollten 70 µg Glykogen pro 1 ml RNA Tri-Flüssig als Carrier für die Präzipitation zugesetzt werden. 2. Nach der Homogenisierung und vor der Zugabe von Chloroform können die Proben einige Monate bei 70 C gelagert werden. Das RNA-Präzipitat kann nach dem Waschen der RNA für 1-3 Wochen bei 4 C in 75%igem Ethanol oder für 1 Jahr bei 20 C gelagert werden. 3. Für die RNA-Extraktion mit RNA Tri-Flüssig können auch Table-Top-Zentrifugen verwendet werden, wenn sie ein Maximum von x g erreichen. In diesem Fall müssen lediglich die Zentrifugationszeiten in den Schritten 2 und 3 auf Minuten verlängert werden. 4. Bei Verwendung von Proben mit hohem Gehalt an Proteinen, Polysacchariden, Fetten oder anderen Bestandteilen ist ein extra Reinigungsschritt ratsam. Vor der Phasentrennung mit Chloroform können unlösliche Bestandteile durch Zentrifugation für 10 Minuten bei Maximalgeschwindigkeit und 4 C entfernt werden. Der Überstand enthält die RNA, während im Pellet die Polysaccharide, extrazellulären Membranbestandteile und hochmolekularen DNAs lokalisiert sind. Bei Proben aus fettreichem Gewebe kommt es zur Bildung einer schaumartigen Fettschicht, die entfernt werden sollte. Der klare, RNAhaltige Überstand wird in ein neues Röhrchen überführt und die Chloroform-Extraktion wie beschrieben durchgeführt. 9

10 Nicht im Kit enthaltene Komponenten Chloroform (frei von Zusätzen, wie z.b. Isoamylalkohol!) Isopropanol 70% Ethanol Polypropylen-Zentrifugenröhrchen (Zentrifugation mit Phenol bei x g!) RNAse-freies Wasser Extraktionsprotokoll 1. Homogenisierung des Ausgangsmaterials a. Gewebeproben 100 mg Gewebe werden mit je 2 ml RNA Tri-Flüssig homogenisiert. Um eine gute Lyse zu erreichen, sollte ein Glas-, ein Teflonoder ein elektrischer Homogenisator verwendet werden. Das Probenvolumen sollte nicht mehr als 10% des verwendeten RNA Tri- Flüssig-Volumens betragen. b. Monolayer-Zellen Monolayer-Zellen werden direkt in der Zellkulturschale durch Zugabe von 1 ml RNA Tri-Flüssig pro 3,5-cm-Schale und durch mehrmaliges Aufziehen mit der Pipette lysiert. Die Menge an benötigtem RNA Tri-Flüssig ist nicht von der Zellzahl, sondern von der Größe der Zellkulturschale (in der Regel 1 ml pro 10 cm2) abhängig. Eine unzureichende Menge an RNA Tri-Flüssig kann zur Kontamination der extrahierten RNA mit DNA führen. 10

11 c. Zellsuspensionen Die Zellsuspension zentrifugieren und mit 1 ml RNA Tri-Flüssig pro 5 x10 6 Zellen (Tier-, Pflanzen-, Hefe- oder Bakterienzellen) resuspendieren. Waschen der Zellen vor der Lyse fördert den Abbau der RNA und sollte vermieden werden. Bei der Extraktion von RNA aus Hefen und Bakterien ist in einigen Fällen eine zusätzliche Homogenisierung bzw. eine enzymatische Vorbehandlung notwendig. 2. Phasentrennung Zunächst die Proben für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend je eingesetztem Milliliter RNA Tri-Flüssig 0,2 ml Chloroform zugeben und die Proben für 10 Sekunden vortexen. Für 3-10 Minuten auf Eis inkubieren. Eine Inkubation bei Raumtemperatur ist ebenfalls möglich, führt aber eventuell zu einer schlechteren Phasentrennung. Die Phasentrennung erfolgt durch Zentrifugation der Proben für 5 Minuten bei x g (bei 4 C). Es bilden sich drei Phasen: eine untere rötliche organische Phase, eine obere farblose wässrige Phase und eine dazwischen liegende Interphase. Die RNA ist ausschließlich in der wässrigen Phase angereichert, während sich DNA und Proteine in der Interphase und in der organischen Phase befinden (Extraktionsprotokolle S.15). Die wässrige Phase nimmt etwa 60 % des Probenvolumens ein. Hinweis: Das verwendete Chloroform sollte frei von Zusätzen, wie z.b. Isoamylalkohol, sein! 11

12 3. RNA-Präzipitation Die wässrige Phase sorgfältig in ein frisches Röhrchen überführen. Ein Verschleppen von Teilen der Interphase ist unbedingt zu vermeiden, da damit auch eine Verschleppung von DNA und letztlich eine Kontamination der RNA mit DNA erfolgt. Es wird empfohlen, nicht den gesamten Teil der wässrigen Phase zu überführen. Die Präzipitation der RNA erfolgt mit dem gleichen Volumen an Isopropanol pro Volumen der überführten wässrigen Phase. Proben für 15 Minuten bei 4 C inkubieren und anschließend für 10 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit ebenfalls bei 4 C zentrifugieren. Das RNA-Präzipitat ist von gelartiger Konsistenz und befindet sich an der unteren Außenseite des Röhrchens. 4. Waschen der RNA Den Überstand vorsichtig abnehmen und das Pellet zweimal mit 1 ml 70%igem Ethanol waschen und anschließend für 10 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren. 12

13 5. Lösen der RNA Das RNA-Pellet kurz an der Luft oder durch Anlegen eines leichten Vakuums trocknen lassen. Ein vollständiges Trocknen des Pellets verschlechtert die Löslichkeit der RNA und sollte deshalb vermieden werden. Die RNA nicht durch Vakuumzentrifugation trocknen!!! Die RNA durch mehrmaliges Auf- und Abziehen mit der Pipette in deionisiertem Formamid, RNase-freiem Wasser oder in 0,5 %igem SDS lösen. Ein Erhitzen der RNA-Lösung auf C verbessert die Löslichkeit. Um eine Kontamination mit RNasen zu verhindern, sollten Wasser und SDS-Lösungen, die zum Lösen der RNA eingesetzt werden, vorher mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandelt werden. Empfohlen werden kann auch die Verwendung von kommerziell angebotenem RNase-freiem Wasser. 13

14 Troubleshooting Problem / mögliche Ursache RNA-Menge zu gering Fehlerbeseitigung Auf vollständige Homogenisierung bzw. vollständige Lyse des Ausgangsmaterials achten RNA-Pellet vollständig lösen; nicht zu stark trocknen A 260/280-Quotient zu gering Probe in größerem Volumen homogenisieren Probe nach Homogenisierung bei RT inkubieren Wässrige Phase war mit der Phenolphase kontaminiert; auf vorsichtiges Abnehmen der oberen wässrigen Phase achten RNA-Pellet vollständig lösen Degradierte RNA Unsachgemäße Lagerung der Ausgangsprobe Vermeidung einer Kontamination mit RNasen während der Präparation Kontamination der RNA mit DNA Probe in größerem Volumen homogenisieren Proben dürfen keine organischen Lösungen (z.b. Ethanol, DMSO, konzentrierte Puffer) oder einen alkalischen ph-wert aufweisen 14

15 Zusatzprotokolle DNA und Protein Extraktion DNA-Extraktionsprotokoll Benötigte Reagenzien und Verbrauchsmaterialien: 100% Ethanol Zentrifugenröhrchen 0,1 M Natriumcitrat/10% Ethanol 75% Ethanol 8 mm NaOH 0,1 M HEPES Die DNA kann nach der Phasentrennung (Schritt 2 RNA- Extraktions-Protokoll, S.11) aus der verbleibenden unteren rötlichen organischen Phase und der Interphase gewonnen werden. 1. DNA-Fällung (Zugabe des Alkohols zur Interphase und zur organischen Phase) 0,3 ml 100% Ethanol pro ursprünglich eingesetzten ml Reagenz zugeben. Gut mischen (invertieren) und für 2 bis 3 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren. DNA durch Zentrifugation bei x g für 15 min bei 4 C pelletieren. 15

16 2. Waschen der DNA Den Überstand entfernen (enthält die Proteine). Das DNA-Pellet zweimal mit 1 ml 0,1 M Natriumcitrat/10 % Ethanol waschen. Jeweils für 30 min bei RT inkubieren, anschließend für 5 min bei x g und 4 C zentrifugieren. DNA in 2 ml 75% Ethanol / ml eingesetztem Reagenz aufnehmen und 15 min bei RT inkubieren. Mehrmals schütteln, dann für 5 min bei x g und 4 C zentrifugieren. 3. Lösen der DNA Das DNA-Pellet für 5 min in leichtem Vakuum trocknen. In 8 mm NaOH lösen (0,3 ml/50 mg Gewebe) und mit einer Pipette mehrmals vorsichtig aufziehen. Falls gelartige Bestandteile in der Lösung sind: erneut für 10 min bei x g zentrifugieren und den Überstand in ein neues Röhrchen überführen. Zur Bestimmung der OD ein Aliquot der Lösung mit Wasser verdünnen. Den ph-wert mit 0,1 M HEPES auf geeigneten Wert einstellen (ph 8.4 für PCRs, ph 8,0 für längere Lagerung). Richtwert: 86 µl 0,1 M HEPES auf 1 ml 8 mm NaOH für ph 8,4; 105 µl für ph 8,0. 16

17 Protein-Extraktionsprotokoll Benötigte Reagenzien und Verbrauchsmaterialien: Isopropanol 0,3 M Guanidinhydrochlorid in 95 % Ethanol 100% Ethanol 1 % SDS Zentrifugenröhrchen Optional: 10 M Harnstoff/50 mm DTT Proteine können nach der DNA-Präzipitation aus der Phenol/Ethanol-Phase extrahiert werden (Überstand aus Schritt 1 der DNA-Extraktion S.15). Die erhaltene Proteinlösung kann direkt zur Untersuchung der Proteine durch Western- Blotting weiter verwendet werden. 1. Protein- Präzipitation Die Proteine werden durch Zugabe von 1,5 ml Isopropanol pro ursprünglich eingesetztem RNA Tri-Flüssig Reagenz zu dem Phenol/Ethanol- Überstand (aus Schritt 1 DNA-Extraktion) präzipitiert. Die Proben 10 min bei Raumtemperatur inkubieren und anschließend für 10 min bei x g und 4 C zentrifugieren. 17

18 2. Waschen der Proteine Den Überstand entfernen. Das Protein-Pellet dreimal mit 2ml 0,3 M Guanidinhydrochlorid in 95% Ethanol pro ursprünglich eingesetzem RNA Tri-Flüssig Reagenz waschen. Dafür bei jedem Waschzyklus die Probe jeweils für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und anschließend bei x g und 4 C für 5 Minuten zentrifugieren. Nach dem letzten Waschschritt das Protein-Pellet in 2ml Ethanol aufnehmen und vortexen. Die Probe 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und erneut bei x g und 4 C für 5 Minuten zentrifugieren. 3. Lösen der Proteine Der kritische Schritt bei der Isolierung von Proteinen aus RNA Tri-Flüssig besteht in der Resolubilisierung aus dem Pellet. Hierfür stehen drei alternative Methoden zur Verfügung, die eine Solubilisierung der Proteine ermöglichen. Verschiedene Arten von Proteinen, vor allem Membranproteine, haben unterschiedliche Löslichkeiten und benötigen möglicherweise unterschiedliche Ansätze zur Solubilisierung. Methode 1: Das Ethanol aus der Probe vollständig entfernen. Das Protein-Pellet in leichtem Vakuum für 5 bis 10 Minuten bei Raumtemperatur trocknen. 1 % SDS zugeben und durch Auf- und Abziehen mit der Pipette lösen. Um das Pellet vollständig zu lösen, kann eine Inkubation der Probe bei 50 C bis 100 C nötig sein. Unlösliche Bestandteile wie Membranreste und extrazelluläres Material durch Zentrifugieren für 10 Minuten bei x g und 4 C sedimentieren. Den Überstand, der die Proteine enthält, in ein 18

19 neues Tube überführen. Die Probe kann direkt für Western-Blot-Analysen verwendet oder bei -20 C gelagert werden. Methode 2: Schwer zu lösende Pellets können alternativ auch durch Beschallen in 10 M Harnstoff/50 mm DTT gelöst werden. Dazu das Ethanol aus der Probe vollständig entfernen. Das Protein-Pellet in leichtem Vakuum für 5 bis 10 Minuten bei Raumtemperatur trocknen. 50 µl frisch angesetzen 10 M Harnstoff/50 mm DTT zugeben und das Pellet mit einer Nadel aufbrechen. Das Gesamtvolumen der zugegebenen Lösung sollte variiert werden, um die gewünschte Konzentration an gelösten Proteinen zu erhalten. Die Probe für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren und anschließend für 3 Minuten auf 100 C erhitzen. Die Probe danach mit 10 Impulsen auf Eis beschallen. Falls zu diesem Zeitpunkt noch nicht alle Proteine in Lösung sind, sollten der Erhitzungs- und der Beschallschritt noch bis zu zweimal wiederholt werden. Die Probe kann direkt für Western-Blot-Analysen verwendet oder bei -20 C gelagert werden. Methode 3: Den Phenol/Ethanol-Überstand aus Schritt 2 bei 4 C gegen dreifach gewechseltes 0,1 % SDS über Nacht dialysieren. Das Dialysat für 10 Minuten bei x g und 4 C zentrifugieren und den klaren Überstand für Western-Blot-Analysen verwenden oder bei -20 C lagern. 19

20 Tipps 1. In einigen Fällen werden mit Aceton bessere Proteinerträge erzielt als bei der Verwendung von Isopropanol. Optimale Ergebnisse sind dabei mit Aceton:Phenol/Ethanol-Verhältnissen von 3:1 bis 6:1 zu erzielen. Generell liegt die Proteinausbeute mit RNA Tri-Flüssig Reagenz bei ca. 40 bis 60 % einer Extraktion mit der SDS-Methode. 2. Das Protein-Pellet, das in in 0,3 M Guanidinhydrochlorid in 95 % Ethanol oder in 100 % Ethanol resuspendiert ist, ist bei 4 C für einen Monat und bei -20 C für mindestens ein Jahr stabil. 3. Proteine können in Anlehnung an die Bradford-Methode quantifiziert werden, wenn der SDS-Gehalt unter 0,1 % beträgt. 20

21 Technische Daten Alle Produkte von werden umfassenden Qualitätskontrollen unterzogen. Dadurch wird gewährleistet, dass sie bei vorschriftsmäßiger Anwendung einwandfrei funktionieren. Versand: Lagerung: bei Raumtemperatur Lichtgeschützt bei 4 C für mindestens 6 Monate haltbar Sicherheitshinweis: Dieses Produkt sollte nur von Personen verwendet werden, die Routine in Laboranwendungen haben. Es sollte laborübliche Schutzkleidung wie Kittel, Handschuhe und Schutzbrillen getragen werden. Bei Kontakt mit Haut und Augen sollten die betroffenen Stellen umgehend mit Wasser gewaschen bzw. ausgespült werden. Anwendungshinweis: In bestimmten Ländern sind einige Anwendungen, für die dieses Produkt eingesetzt werden kann, patentrechtlich geschützt. Da durch den Kauf keine Lizenzen erworben werden, kann abhängig vom Anwendungsland und der Anwendung der Erwerb entsprechender Lizenzrechte erforderlich sein. 21

22 Notizen 22

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