Oligo Click S Reload ROTI kit für DNA labeling

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1 Gebrauchsanweisung Oligo Click S Reload ROTI kit für DNA labeling

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3 ROTI kit für DNA labeling Carl Roth GmbH + Co. KG Oligo Click S Reload ROTI kit für DNA labeling Für die Markierung von bis zu 10 nmol Oligonukleotid (1 bis 2 Alkine) durch Click Chemie 9 Reaktionen Nur für Laborzwecke geprüft: Die Informationen in diesem Dokument können sich jederzeit ohne Vorankündigung ändern. Die Carl Roth GmbH + Co. KG übernimmt keine Verantwortung für Fehler, die in diesem Dokument enthalten sein können. Die Carl Roth GmbH + Co. KG lehnt jegliche Haftung in Bezug auf dieses Dokument, weder ausdrücklich noch stillschweigend, ab, dies schließt unter anderem die Marktfähigkeit oder die Eignung für einen bestimmten Zweck mit ein. In keinem Fall ist die Carl Roth GmbH + Co. KG haftbar, weder vertraglich, bei unerlaubter Handlung, unter Garantie noch unter jeder Statue oder auf jeder anderen Grundlage für spezielle, zufällige, indirekte, Mehrfach- oder Folgeschäden im Zusammenhang mit diesem Dokument oder auch diesem Dokument Hervorgehendes, einschließlich, aber nicht beschränkt auf dessen Verwendung. Gefahren: Activator: l g Achtung H226-H319-H335 P210-P280-P303+P361+P353-P305+P351+P338-P312a MSDS: das entsprechende MSDS kann von unserer Website heruntergeladen werden. Zitation in der Literatur: Wir bitten Sie bei der Veröffentlichung eines Verfahrens unter Verwendung dieses Produkts, darauf mit dem Namen Carl Roth s ROTI kit für DNA labeling (Oligo Click S Reload) zu verweisen. Wir empfehlen das folgende allgemeine Protokoll der Carl Roth GmbH + Co. KG für die Markierung von Alkin-modifizierten Oligonukleotiden (bis zu 10 nmol) mit Marker-Aziden durch Click Chemie zu verwenden. Das Marker-Azid sowie die anderen Hilfsreagenzien können bei der Carl Roth GmbH + Co. KG auch separat bestellt werden. 1

4 Carl Roth GmbH + Co. KG ROTI kit für DNA labeling Protokoll A. Allgemeine Anmerkungen Dieses Protokoll ist für die Markierung von bis zu 10 nmol eines einfach- oder zweifach Alkin-modifizierten Oligonukleotids mittels Kupfer(I)-katalysierter Azid- Alkin-Cycloaddition (CuAAC; Click Chemie) optimiert. Der Reactor S beeinhalten einen stabilen heterogenen Katalysator, der sich während der Reaktion nicht auflöst. Die Markierungsreaktion läuft in konzentrierten Lösungen von Alkinen (Oligo) und Aziden (Marker-Azid, L-N3) effizienter. Am besten lässt sich die Click-Reaktion durchführen, wenn das Oligo und das Marker- Azid in einer minimalen Menge an Lösungsmittel zusammengegeben werden. Die Click-Reaktion kann in der Regel durch erhöhte Temperaturen beschleunigt werden und kann so z.b. bei einer Reaktionstemperatur von 45 C in 30 min vollständig sein. Niedrige Reaktionstemperaturen (bis etwa 4 C) sind in Kombination mit längeren Reaktionszeit auch möglich. Die Reaktionszeit ist abhängig von: a) der Konzentration von Azid und Oligo in der Lösung; b) der Reaktionstemperatur; c) Rühren und / oder Mischen der Lösung; d) dem sterischen Anspruch des Azids für Zweifach-Markierungsreaktionen. Im letzteren Fall werden verlängerte Reaktionszeiten (4 h) empfohlen. B. Material und Lagerbedingungen für bis zu 9 individuelle Markierungsreaktionen unter Verwendung des Oligo Click S Reload Kits. C. Benötigte Materialen und Ausrüstung nicht in diesem Kit enthalten Alkin-modifiziertes Oligonukleotid oder Alkin-modifiziertes PCR-Fragment Marker-Azid (10 mm) Zentrifuge (optional gekühlt) Mikrozentrifugenröhrchen 2

5 ROTI kit für DNA labeling Carl Roth GmbH + Co. KG Thermomixer (optional) Ethanol 95% 3 M Natrium-Acetat-Lösung (3 M NaOAc) oder 3 M Ammonium-Acetat Lösung (NH 4 OAc). D. Arbeitsablauf E. Click Protokoll für Oligonukleotide und PCR Markierung 1. Vorbereitung der Oligonukleotide oder PCR Fragmente (beides nicht im Kit enthalten) Lösen Sie das Oligonukleotid in der entsprechenden Menge an Wasser um eine 0,1-1 mm Lösung zu erhalten und zentrifugieren Sie diese kurz. (Es können unterschiedliche Konzentrationen verwendet werden. Sehen Sie dazu bitte die Reaktionstabelle auf Seite 6) oder Lösen Sie das PCR Fragment in einer entsprechenden Menge an Wasser oder Puffer (bitte verwenden Sie kein EDTA oder EDTA-haltigen Puffer) um eine ca ng/µl Lösung zu erhalten und zentrifugieren Sie diese kurz. 3

6 Carl Roth GmbH + Co. KG ROTI kit für DNA labeling 2. Herstellung einer 10 mm Marker-Azid (L-N 3 ) Lösung 1 (Wählen Sie Ihre bevorzugte Oligo-Click / Azid Kombination von Nehmen Sie das Ihr ausgewähltes Marker-Azid L-N3 aus dem Gefrierfach und lassen Sie dieses langsam auf Raumtemperatur aufwärmen. 2.2 Zentrifugen Sie kurz, um alles L-N3 auf dem Boden des Röhrchen zu platzieren. 2.3 Geben Sie (100,000 / MW L-N3 ) µl Solvent (Roti click Grade) 2 in das Röhrchen mit dem Marker-Azid Vortexen Sie das Röhrchen bis sich das Marker-Azid vollständig gelöst hat. 2.5 Zentrifugieren Sie kurz ab. 3. Durchführung der Click-Reaktion (1-2 Minuten Vorbereitung + 1 Std. Reaktion) (Beachten Sie: der Katalysator ist ein Feststoff und löst sich während der Click-Reaktion nicht.) [Schritt 1] Zugabe von 3 µl Aktivator (gelbes Röhrchen) zum grünen Röhrchen. [Schritt 2] Zugabe der korrekten Menge an Oligo oder DNA-Lösung 4 zum grünen Röhrchen aus Schritt 1. [Schritt 3] Zugabe der korrekten Menge 5 an Marker-Azid-Lösung (L-N 3 ; siehe Reaktionstabelle auf Seite 6) zum grünen Röhrchen aus Schritt 2. [Schritt 4] Vortexen des grünen Röhrchens aus Schritt 3 für 10 Sekunden. Kurzes Abzentrifugieren. [Schritt 5] Stellen Sie das grüne Röhrchen aus Schritt 4 für eine Stunde in einen Thermomixer bei 45 C unter leichtem Schütteln (700 rpi nicht überschreiten) oder in ein Wasserbad bei 45 C für eine Stunde. Sie können die Reaktion auch bei Raumtemperatur (RT) durchführen. In diesem Fall verwenden Sie eine längere Reaktionszeit (2-4 h). WICHTIG: Mischen/Schütteln Sie immer wieder das Gefäß während der Reaktion. 1 Die beschriebene Vorgehensweise ist nur für Marker-Azide, die in DMSO löslich sind, anwendbar. Sie können jedoch auch reines Wasser oder ein anderes Lösungsmittel wählen, das mit dem von Ihnen ausgewählten Marker-Azid kompatibel ist. 2 Dieses Lösungsmittel enthält eine DMSO / t-buoh-mischung. Das entsprechende Sicherheitsdatenblatt finden sie auf (Best. Nr. 7815). 3 Das Molekulargewicht MW L-N3 ist auf Seite 12 angegeben. Siehe auch das Berechnungsblatt auf Seite 7. 4 Siehe auch Minimale Oligo Konz. und Maximales Reaktionvolumen in der Reaktionstabelle auf Seite 6. 5 Siehe Reaktionstabelle auf Seite 6 oder das Berechnungsblatt auf Seite

7 ROTI kit für DNA labeling Carl Roth GmbH + Co. KG 4. Aufarbeitung (15 20 Minuten) [Schritt 6] 4.1 Überführung der flüssigen Phase in ein neues leeres Röhrchen. 4.2 Waschen Sie das grüne Röhrchen das noch den festen Katalysator beinhaltet mit 60 µl 3 M NaOAc. 4.3 Sammeln Sie nur die flüssige Phase aus Punkt 4.2 und überführen Sie diese in das neue leere Röhrchen mit Ihrem markierten Oligonukleotid aus Punkt 4.1. Fahren Sie mit Ihrer bevorzugten DNA Fällungsmethode fort oder befolgen Sie Punkt Fällungsprotokoll [Schritt 7] 5.1 Zugabe von 1 ml kaltem Ethanol 95% 5.2 Zentrifugieren Sie für mindestens 15 Minuten bei 4 C oder kühlen Sie das Produkt zuerst eine Stunde lang bei -20 C und zentrifugieren dann. 5.3 Entfernen Sie den Überstand. Trocknen Sie den Rückstand an Luft (bei fluoreszenten Markern: vor Licht schützen). 5.4 Lösen Sie die Pellets in der gewünschten Menge an Wasser oder Puffer. Ihr markiertes Oligonukleotid / DNA ist nun für Ihre weiteren Experimente / Tests bereit. Das Endprodukt kann Spuren von freiem Marker-Azid enthalten. Anwendbare Reinigungsverfahren: 1. Entsalzung. 2. RP-HPLC. 3. Gelelektrophorese. 5

8 Carl Roth GmbH + Co. KG ROTI kit für DNA labeling Reaktionstabelle: Verwenden Sie die folgende Tabelle um die Menge an Reagenzien (Activator und Azide), die Sie in Ihrer Oligonukleotid-Markierungsreaktion benötigen, zu berechnen. 6 Benutzen Sie dazu die entsprechende Mengenangabe des Marker-Azids (Spalte "µl Azide (Rot)"), abhängig von der Menge an Oligonukleotid (Spalte "Oligo nmol Bereich") und der Anzahl an in der Sequenz vorhanden Alkinen (Spalte "Alkin Gehalt-Bereich") Fügen Sie die Reagenzien wie in Punkt 3 dieses Protokolls beschrieben zusammen. Oligo nmol Bereich Alkin Gehalt- Bereich µl Activator (Gelb) µl Azide (Rot) Reactor (Grün) Minimale Oligo Konz. Maximales Reaktionsvolumen in µl 0-2 Dieser Bereich entspricht für ein 22mer 0 0,4 OD oder 0 13 µg S 0.1 mm Dieser Bereich entspricht für ein 22mer 0,7 1,3 OD oder µg S 0.1 mm Dieser Bereich entspricht für ein 22mer 1,5 2,2 OD oder µg S 0.1 mm Für eine detaillierte Berechnung siehe Seite 7-9 dieser Gebrauchsanweisung. Verwenden Sie die Azid Tabelle auf der Seite 10, um die Menge an Marker-Azid in Ihrer Markierungsreaktion zu minimieren. 6

9 ROTI kit für DNA labeling Carl Roth GmbH + Co. KG Anhang F. Berechnungsblatt 1 Herstellung einer 10 mm Marker-Azid (L-N 3 ) Lösung Die Menge an Lösungsmittel V L in µl, die notwendig ist um ausgehend von 1 mg Marker-Azid (L-N 3 ) eine 10 mm Lösung herzustellen wird berechnet in dem man die Zahl durch die Molare Masse des Marker-Azids (Mw L-N3 ) dividiert. Beispiel: m Marker-Azid = m FAM-N3 = 1 mg MW L-N3 = g/mol V L = 100,000 / = µl C Azid = 10 mm 1.1 Entnehmen Sie das Röhrchen, das 1 mg Marker-Azid beinhaltet, dem Gefrierschrank und lassen Sie dieses langsam auf Raum Temperatur aufwärmen. 1.2 Zentrifugieren Sie kurz ab, um die gesamte Menge an Marker-Azid auf den Boden des Röhrchens zu bekommen. 1.3 Geben Sie V L (µl berechnet in 1) an Lösungsmittel Solvent (Roti click Grade) in das Röhrchen mit dem Marker-Azid. 1.4 Vortexen Sie das Röhrchen bis sich das Marker-Azid vollständig gelöst hat. 1.5 Zentrifugieren Sie kurz ab. Diese Lösung hält sich bei Lagerung bei -20 C im Dunkeln für mehrere Monate. (siehe auch die entsprechende Betriebsanweisung des jeweiligen Marker-Azids). Azide sind sehr stabile funktionelle Gruppen, weswegen eine Hydrolyse bei Wasserkontakt nicht zu befürchten ist. G. Click-Reaktion - Berechnungsblatt Verwenden Sie die Reaktionstabelle auf Seite 7 um die Menge an Marker-Azid (L-N3), das Sie für Ihr Experiment benötigen, auszulesen. Nutzen Sie die Azid Tabelle auf Seite 10 um Ihren Verbrauch an Marker-Azid in der Markierungs-Click-Reaktion zu minimieren. Im Folgenden lesen Sie, wie Sie diese Werte selbst berechnen: 1. Oligonukleotid Markierung: 1.1 Berechnung der Menge an Oligonukleotid n oligo in nmol: n oligo [nmol] = m [ng] / MW [g/mol] n [nmol] = c [mm] x V [µl] 1.2 Sollten Sie eine vorgegebene Konzentration in der Einheit c [ng/µl] haben, dividieren Sie diese Zahl durch die Molare Masse Mw [g/mol] Ihres Oligos um die Konzentration in nmol/µl zu erhalten. Multiplizieren Sie diese Zahl dann mit dem Gesamtvolumen in µl um die Gesamtstoffmenge Ihres Oligos n oligo zu berechnen. 7

10 Carl Roth GmbH + Co. KG ROTI kit für DNA labeling Beispiel: Oligonukleotid enthält zwei Alkine und folgende Spezifikationen: c oligo = 250 ng/µl MW oligo = 6500 g/mol Gesamtvolumen = V oligo = 150 µl Gesamtstoffmenge = n oligo = (250 / 6500) x 150 = 5,8 nmol 1.3 Multiplizieren Sie n oligo mit der Gesamtzahl der enthaltenen Alkine, um die Stoffmenge an Alkinen n Alkin in nmol zu berechnen. Oligo enthält 2 Alkine n oligo = 5,8 nmol n Alkin = 5,8 x 2 = 11,6 nmol 1.4 Die Click Reaktion benötigt nur 2 Äquivalente an Azid. Multiplizieren Sie daher n Alkin mit 2 um n Azid in nmol zu erhalten. n Azid = 11,6 x 2 = 23,2 nmol 1.5 Dividieren Sie n Azid durch die Azid Konzentration c Azid = 10 mm um das Volumen an Azid-Lösung (V Azid in µl) zu berechnen, das in Ihrer Reaktion eingesetzt werden soll. V Azid = n Azid / c Azid = 23,2 / 10 = 2,3 µl Setzen Sie 2,3 µl an 10 mm Marker-Azid-Lösung in Ihrer Click Reaktion ein. 2. PCR Markierung: So berechnen Sie die Menge an Azid (L-N 3 ), die Sie für Ihre Markierungsreaktion von Alkin-modifizierter DNA benutzen möchten. Die DNA-Markierungsrate kann über die zugegebene Menge an Azid eingestellt werden und muss für jedes neue/individuelle DNA-Templat neu berechnet werden. 2.1 Bestimmen Sie photometrisch die DNA Konzentration c DNA [ng/µl] nach PCR Aufreinigung. 2.2 Berechnen Sie das Molekulargewicht MW (g/mol) Ihres DNA-Templats (MW DNA ): MW DNA [g/mol] = 600 g/mol x bp 600 g/mol ist die durchschnittliche Masse eines Basenpaares bp = Anzahl an Basenpaaren in Ihrem DNA-Templat 2.3 Berechnung der Gesamtstoffmenge an DNA n DNA in nmol in Ihrer Probe: n DNA [nmol] = c DNA [ng/µl] x V DNA [µl] / MW [g/mol] c DNA [ng/µl]: gemessen in 2.1 MW DNA [g/mol]: berechnet in 2.2 V DNA [µl] = Volumen Ihrer Probe (mit Pipette abzumessen) 2.4 Berechnen Sie die Gesamtzahl der endständigen Alkinmodifikationen n Alkin in nmol in Ihrer DNA. Dieser Wert stimmt mit der Anzahl an Thymidinen in Ihrer DNA überein, sofern alle dttp mit C8-Alkyne-dUTP während der PCR ersetzt wurden: n Alkin [nmol] = [(bp x AT-Gehalt %) / 100] x n DNA [nmol] 8

11 ROTI kit für DNA labeling Carl Roth GmbH + Co. KG bp = Anzahl an Basenpaaren in Ihrem DNA-Templat AT-Gehalt % = Prozent an A s/t s in Ihrer DNA n DNA (nmol) = berechnet in 2.3 Falls Sie dctp durch C8-Alkyne-dCTP während der PCR ersetzt haben sollten, berechnen Sie n alkynes in nmol in Ihrer DNA wie folgt: n Alkin [nmol] = (bp x GC-content %) / 100 x n DNA [nmol] bp = Anzahl an Basenpaaren in Ihrem DNA-Templat GC-Gehalt % = Prozent an G s/c s in Ihrer DNA n DNA [nmol] = berechnet in Berechnen Sie die Menge an Marker-Azid n Azid in nmol, die Sie für die Markierung der Alkin-modifizierten DNA benötigen. Die DNA-Markierungsrate hängt von der zugegebenen Menge an Azid ab. Normalerweise werden 1-30 Äquivalente an Azid benutzt, was zu Markierungsraten von bis zu 20% und mehr führt! n Azid [nmol] = n Alkin [nmol] x k n Alkin [nmol] = berechnet in 2.4 k = Äquivalente an Azid (üblicherweise zwischen 1 30) V Azid (Marker Azid; 10 mm) = n Azid [nmol] / 10 nmol/µl Setzen Sie V Azid [µl] an 10 mm Marker-Azid-Lösung in Ihrer Click-Reaktion ein. 9

12 Carl Roth GmbH + Co. KG ROTI kit für DNA labeling H. Azid Tabelle Verwenden Sie folgende Tabelle um die Mindestmenge an Marker-Azid auszulesen, die Sie in Ihrer Markierungs-Click-Reaktion benötigen und reduzieren Sie so den Verbrauch an Marker-Azid falls nötig. Wenn Sie zum Beispiel 7 nmol eines Oligonukleotids (nmol Oligo = 7), das 1 Alkine in der Sequenz beinhaltet (Anzahl Alkine = 1) dann benötigen Sie 1,4 µl an 10 mm Marker-Azid- Lösung. 7 Anzahl Alkine 1 2 nmol Oligo µl Azid µl Azid 1 0,2 0,4 2 0,4 0,8 3 0,6 1,2 4 0,8 1,6 5 1,0 2,0 6 1,2 2,4 7 1,4 2,8 8 1,6 3,2 9 1,8 3,6 10 2,0 4,0 Fehlerbehebung Wenn die Markierung nicht vollständig sein sollte, dann können Sie entweder die Reaktionszeit oder auch die Reaktionstemperatur erhöhen (v.a. bei Mehrfachmarkierungsreaktionen und bei Aziden mit hohem sterischen Anspruch empfohlen). 7 Die Menge an Marker-Azid in der Reaktionstabelle auf Seite 6 gibt hierfür z.b. 4,0 µl an. Dies deckt den Bereich von 7 bis 10 nmol Oligo, mit 1 bis 2 Alkinen in der Sequenz ab. 10

13 ROTI kit für DNA labeling Carl Roth GmbH + Co. KG Notizen: 11

14 Carl Roth GmbH + Co. KG ROTI kit für DNA labeling Bestellinformationen: (für detaillierte Informationen zum Kitinhalt siehe Tabelle unter Punkt B.) ROTI kits für DNA labeling: Best. Nr. Produkt mitgeliefertes Marker-Azid Reactor Oligo Click S Reload - 9 x 2,5 mg Oligo Click M Reload - 9 x 5 mg Oligo Click S Oligo Click M Oligo Click S Oligo Click M Oligo Click S-Biotin Oligo Click M-Biotin 6-FAM-Azide MW L-N3 = g/mol 6-FAM-Azide MW L-N3 = g/mol 5-TAMRA-Azide MW L-N3 = g/mol 5-TAMRA-Azide MW L-N3 = g/mol Biotin Azide MW L-N3 = g/mol Biotin Azide MW L-N3 = g/mol 7 x 2,5 mg 7 x 5 mg 7 x 2,5 mg 7 x 5 mg 7 x 2,5 mg 7 x 5 mg Für ihre Bestellung kontaktieren Sie uns bitte unter: Tel: +49 (0)721/ Fax: +49 (0)721/ info@carlroth.com 12

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16 Carl Roth GmbH + Co. KG Schoemperlentraße Karlsruhe, Germany Tel: +49 (0)721/ Fax: +49 (0)721/ info@carlroth.com