PYRANOSEN.ALS ZUCKEREINHEITEN

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1 Diss.ETHNr.9377 SYNTHESE UND STRUKTURELLE CHARAKTERISIE RUNG VON ADENINOUGONUKLEOTIDEN MIT 2, 3DIDEOXYD UND LGLUCO PYRANOSEN.ALS ZUCKEREINHEITEN ABHANDLUNG Zur Erlangung des Titels eines DOKTORS DER NATURWISSENSCHAREN der EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE. ZÜRICH vorgelegt von MARKUS PETER BÖHRINGER dipl. Chem. ETH geboren am 6. März 1961 von Zürlch/ZH Angenommen auf Antrag von Prof. Dr. A. Eschenmoser, Referent Prof. Dr. D. Arlgoni. Korreferent Zürich 1991

2 6) IX A. ZUSAMMENFASSUNG Zur Synthese von AdeninOligonukleotiden der HomoDNAReihe, d. h. von AdeninOligonukleotiden mit 2', 3Dideoxyglucopyranosen als Zuckerbausteine (dd An) wurde aus 3,4,6TriOacetylDglucal (2) über vier Stufen Methyl4, 6di0benzoyl2,3dideoxyaDglucopyranosid (6) in guter Ausbeute hergestellt. Nach der Methode von Vorbrüggen (36) wurde 6 mit N6Benzoyladenin (3) zu N6Benzoyl9(4', 6'di0 benzoyl2', 3'dideoxyßDglucopyranosyl)adenin (8) nukleosidiert. Die Konstitution von 8 wurde mit Hilfe einer Kristallstrukturanalyse bewiesen. In Anlehnung an die PhosphoramiditMethode zur Synthese von DNAOligonukleotiden (43 53) wurde das an die Festphase gebunde ne dd ADerivat 14 (Starteinheit) sowie die Amidite 16,17 und 21 (Verlän gerungseinheiten) aus 8 synthetisiert. Die OllgonukleotidSynthesen von dd An, n = 2 12, wurden sodann nach der FestphasenMethode (43,44) durchgeführt, wie sie für Oligonukleotide der DNAReihe bekannt ist. Kleine SyntheseAnsätze (s lumol, dd An, n = 6 12) wurden maschinell, d. h. am DNASynthesizer, grössere Ansätze (> lumol, s44jimol, dd An, n = 2 manuell durchgeführt. Zudem wurde dd A2 auch in Lösung (Starteinheit: 13) hergesteift. In allen Fällen wurden durchwegs gute Kopplungsausbeuten erzielt. Mit Umkehrphasen und resp. oder lonentauscherhplc wurden die synthetisierten dd AOligonukleotide gerei nigt. HPLCChromatographie, FABMassenspektrometrie (dd An, n = 2,3, 6) und NMRSpektroskopie OH und 31PNMR: dd An, n = 2,3,6.13CNMR: dd A2.) weisen auf eine hohe Reinheit der isolierten Oligonukleotide hin. Kooperatives Verhalten: Mit verschiedenen experimentellen Metho den wurde das Paarungsverhalten von dd Aö untersucht. So wurde in Abhängigkeit der Temperatur die UVAbsorption von dd A(, bei 260nm bestimmt. Der dabei gefundene, sigmaoide Kurvenverlauf (Schmelz kurve) ist Ausdruck eines kooperativen Oberganges zwischen zwei Zu ständen von dd A$. Entsprechende Beobachtungen werden auch bei der Untersuchung der Temperaturabhängigkeit der CDMaxima resp. der chemischen Verschiebung von Protonen im 1 HNMR von dd A$ge

3 38), 38 X macht. Zusammen mit dem nichthomologen ReversedPhaseHPLchromatographischen Verhalten von dd A12 gegenüber dd An, n 1 = 8, haben diese experimentellen Befunde zur paarung von dd Aö geführt. Hypothese einer Selbst Selbstpaarung: Die Hypothese der Selbstpaarung von dd A(, wurde mit verschiedenen Experimenten bestätigt: Der TmWert von dd At, nimmt im UVspektroskopisch verfolgten Paarungsexperiment bei Erhö hung der Oligonukleotidkonzentration deutlich zu, was nur mit einem inter, nicht aber mit einem intramolekularen Prozess vereinbar ist. Zudem sind die beobachteten NOESYCrosspeaks zwischen CH(2) und NH2(6) nur intermolekular, d. h. als Folge einer Paarung rationalisier bar. Weiter ist die in dd Af, gegenüber dd A2 verlangsamte ih^daus tauschgeschwindigkeit der CH(8)Protonen ein Hinweis auf eine Selbst paarung. In den von H.J. Roth (16) durchgeführten Paarungsexpe rimenten kann die Selbspaarung von dd Aö durch ddtoligonukleotide nicht gebrochen werden. Stöchlometrie: Die Stöchiometrie eines solchen dd AöKomplexes ist aus Experimenten mit dd A$ alleine nicht ableitbar. Da aber nur unter der Annahme, dass dd At als Duplex vorliegt, aus TmWerten thermodynamische Daten für den Schmelzprozesses des dd AöAssoziates erhalten werden, die von vergleichbarer Grösse wie bekannte Werte für Oligonukleotide der DNAReihe sind, ist zu vermuten, dass dd A6 als Duplex (dd A$)2 und nicht als höheres Assoziat vorliegt. Oligonukleotide, bestehend aus zwei intramolekular verbrückten dd AnTeilsträngen (36 weisen in ihrer intramolekular gepaarten Form den selben Schmelzkurven und CDTypus wie dd Aö auf. Da die gepaarte Form dieser Oligonukleotide 36 aus genau zwei dd An Teilsträngen bestehen, ist auch für dd At in Duplex wahrscheinlich. Weiter unterstützen Untersuchungen mung der Stöchiometrie in AAgepaarten, von J. Hunziker (17) zur Bestim dd Add Genthaltenden HomoDNAOligonukleotiden das stöchlometrische Postulat eines dd ADuplexes. Im Unterschied zu PurinPyrimidinTripelsträngen weisen Modellbe trachtungen von dd AnDoppel und Tripelsträngen darauf hin, dass für dd AnTripelstränge und höherere Assoziate, nicht aber für Duplexe, mit deutlichen interstrang Phosphatrepulslonen gerechnet werden muss.

4 XI Konformation des ZuckerPhosphatRuckgrates: NOESY und COSY Experimente zeigen, dass in (dd Aö)2 alle glycosidischen Bindungen antikonformation aufweisen und alle Pyranoseeinheiten in Sesselkon formation vorliegen. Innerhalb eines gepaarten Einzelstranges werden einzig sequentielle Unterschiede in der chemischen Verschiebung der Phosphatgruppen (und damit in a und C?) beobachtet. Ausgehend vom idealisierten (linearen) HomoDNAModell wird für das ZuckerPhosphatRückgrat des Duplexes (dd Aö)2 eine Konforma tion (hypothetisches RealModell) postuliert, die mit allen Resultaten der NMRExperimente übereinstimmt. Dieses RealModell gehört dem sel ben Konformationstyp an wie das idealiserte HomoDNAModell. Sein Pitch beträgt ca. 450Ä (.ca. 130 Mononukleotideinheiten). Basenpaarung: Neben einem Dimeren (dd Aö)2. bei dem die Ein zelstränge durch Basenpaarung verbunden sind, ist auch ein Dimer denkbar, bei dem zwei Einzelstränge durch Basenstacking alleine ver bunden, d. h. aufeinandergestapelt sind. Die beobachtete Erhöhung der dd An TmWerte im Schmelzexperiment bei vergrösserter Mononukleotidzahl n oder bei erhöhter Salzkonzentration lässt sich aber mit letzterem Modell nicht erklären. Hinweise, dass Basenpaare die Einzelstränge des Dimeren (dd Aö)2 verbinden, sind die beobachteten NOESYCrosspeaks zwischen CH(2) und NH2(6) sowie die denaturierende Wirkung von Harnstoff in den UV Schmelzexperimenten von (dd Aö)2. Weiter kann der gefundene Unter schied der chemischen Verschiebung der Amioprotonen in dd A3 und dd Aö als Indiz einer Basenpaarung verstanden werden. Antiparallelität von (dd A*)2: Wie Versuche mit intramolekular verbrück ten dd ATeilsträngen zeigen, ist antiparallele AAPaarung für (dd An)2 thermodynamisch stabiler als für parallele. Daher sind auch für (dd Aö)2 antiparallel zueinander angeordnete Einzelstränge zu postu lieren, in Übereinstimmung mit den Erwartungen aus Modellbetrachtun gen von (dd Aö)2 und mit der von H.J. Roth (16) und J. Hunziker (17) be obachteten Antiparallelität in anderen HomoDNADuplexen. Basenpaarungstyp: Auf Grund der Konformation des Zucker PhosphatRückgrates, der antikonformation der glycosidischen Bindung und der Antiparallelität der Einzelstränge sind im Modell nur WatsonCrickHoogsteenartige Basenpaarung oder AAIminoPaa

5 XII rung möglich. Resultate von Schmelzexperimenten von U. Diederichsen (81) mit dd I und von J. Hunziker (17) mit dd Genthaltenden Oligonukleotiden lassen schliessen, dass in (dd A$)2 keine AAIminc Paarung vorliegt. Daher ist für (dd A$)2 WatsonCrickHoogsteenartige Basenpaarung zu postulieren. Kristallisationsversuche: Versuche zur Kristallisation von dd An, n 2 = 6, ergaben zu kleine Kristalle für eine Röntgenstrukturanalyse. Hingegen konnte von dd A die Kristallstruktur (P2i2i2i) bestimmt werden. Dabei sind die einzelnen Nukleoside dd A durch WatsonCrickHoogsteenartige Basenpaare zu bandartigen Strukturen verknüpft. Schmelzvorgang: UV, CD und NMRspektroskopische Experimente weisen darauf hin, dass dd AOligonukleotide mit kleinen Mononukleotidzahlen (n 2 oder 3) als Modellverbindungen = für den ungepaarten Zustand von dd Aö betrachtet werden können. Daher ist auf Grund von NMRspektroskopischen Untersuchungen zur Bestimmung der Konfor mation von dd A2 zu vermuten, dass das ZuckerPhosphatRückgrat der gepaarten und ungepaarten Form von dd A$ dem gleichen Konfor mationstyp angehören, d. h. dass der ungepaarte dd A6Einzelstrang in einer zur Paarung präorganisierten Form vorliegt. Dieser Hypothese entsprechend ist zum einen im UV bereits für dd An, n > 3, eine Selbst paarung zu beobachten und zum anderen ist der Paarungsvorgang für dd Aö entropisch deutlich günstiger als für Oligonukleotiden der DNA Reihe. Nach den selben Vorschriften wie für die Dkonfigurierten dda Nukleotide wurden auch die Lkonfigurierten dd ANukleotide L14 und L17, sowie Ldd A$ ausgehend von L6 (16) synthetisiert. Weder aus den UVspektroskopisch beobachteten Paarungsexperimenten noch aus 1 HNMRExperimenten der racemischen Mischung von DddAö und Ldd Aö können Hinweise auf eine racemische Paarung gewonnen werden.

6 53). 8). XIII B. SUMMARY For the synthesis of HomoDNA adenine oligonucleotides, i. e. adenine oligonucleotides with 2', 3'dideoxyglucopyranose as sugar moiety (dd An), methyl4, 6di0benzoyl2,3dideoxyaDglucopyranoside (6) was synthesized in four steps from 3,4,6triOacetylDglucal (2) in good yield. Following the method of Vorbrüggen (36), nucleosidation of 6 was accomplished with N6Benzoyladenin (3) to provide N6Benzoyl9(4', 6'di0benzoyl2', 3'dideoxyßDglucopyranosyDadenine (8). The Constitution of 8 was proved by Xray analysis. The solid supportbound dd Aderivative 14 (starting unit) as well as the amidites 16,17 und 21 (elongation units) were synthesized from 8, according to the phosphoramidite method for the synthesis of DNA oligonucloetides (43 Synthesis of oligonucleotides dd An (n = 2 12) followed the known solid support procedures (43,44) for natural DNA synthesis. Small scale synthesis ( lumol, ddan, n 612) = was performed of an automated DNA Synthesizer, and large scale synthesis (> lumol, 44nmol, dd An, n 26) = was done by hand. In addition, dd A2 was also prepared in Solution (starting unit: 13). In all cases we achieved good coupling yields. The dda oligonucleotides were purified by reversedphase and/or ionexchanghplc. High purity of all the isolated oligonucleotides was demonstrated by HPLCchromatography, FABmass spectrometry (dd An, n 2,3,6) and NMRspectroscopy OH und 3ipNMR: dd An, n = 2,3,6.13CNMR: dd = A2.). Cooperative behaviour: The character of pairing of dd A6 was investigated by various methods. The temperature dependence of the UV absorbance of dd Aöwas detected at 260nm. A sigmoidal graph (melting curve) was found demonstrating a cooperative transition between two states of dd A6. Simllar results were observed while detecting temperature dependence of CD maxima or chemical shifts In ] HNMR of dd A$. Furthermore, a nonhomologous behaviour under reversedphase chromatography conditions was observed for dd A12 compared with dd An (n = 1 These

7 38) 38 xrv experimental results have led to the hypothesis of a selfpairing ddaö. of Selfpairing: The hypothesis of selfpairing of dd Aö was confirmed by various experiments: The Tmvalue from dd Aö detected in the UVspectroscopically observed pairing experiment is raised by increasing the oligonucleotide concentration. This corresponds only with a intermolecular process, but not with a intramolecular one. Furthermore, the observed NOESY crosspeaks between CH(2) und NH2(6) are only intermolecular, i. e. rationalizable as a consequence of pairing. Moreover, the smaller! H2Dexchange rate of the CH(8) protons in dd Aö compared to dd A2 is an indication of selfpairing. In pairing experiments carried out by H.J. Roth (16), selfpairing of dd Aö cannot be broken by dd Toligonucloetides. Stoichlometry: The stoichiometry of such a dd Aöcomplex is not deducible from experiments only with dd Aö. But under the assumption that dd Aö exists as a duplex, we calculated thermodynamic data from Tmvalues which are of similar magnitude to thermodynamic values of DNA oligonucleotides. Therefore, we suppose that dd Aö exists as a duplex (dd Aö)2 and not as a complex of higher order. Oligonucleotides with two intramolecularly connected dd An Strands (36 show in the intramolecularly paired form the same typical melting curve and CDspectra as dd Aö. Because the paired form of these oligonucleotides 36 dd Aö a duplex is likely. consists of two dd An Strands, thus for In addition, experiments carried out by J. Hunziker (17) to determine the stoichiometry of AApaired, dd A and dd Gcontaining HomoDNA oligonucleotides supported the stoichiometrical postulate of a dd A duplex. Different from purinepyrimidine triplestranded oligonucleotides, modeis of dd An double and triplestrands suggest that for dd An triplestrands and complexes of a higher order, but not duplexes, a significant interstrand phosphate repulsion has to be expected. Conformation of the sugar phosphate backbone: NOESY and COSY experiments show that in (dd Aö)2 all glycosidic bonds are in anti conformation and all pyranose units are in a chair conformation. In the

8 39 XV paired form of dd Aö sequential chemical shift differences of only the phosphate groups (and therefore in a and C?) are observed. Starting with the idealized (linear) HomoDNA model a conformation for the sugar phosphate backbone of the duplex (dd Aö)2 is postulated (hypothetically real model). This model coincides with all results of the NMR experiments. It belongs to the same type of conformation as the idealized HomoDNA model. Its pitch is approx. 450Ä (approx. 130 mononucleotide units). Base pairing: Another possible dimer model not connected by base pairs is one with two stacked Single Strands. The Observation that oligonucleotide Tmvalues increase when the mononucleotide number n or the salt concentration are raised contradicts this last model. Some indications that base pairs are connecting the Single Strands of the dimer (dd Aö)2 are the observed NOESY crosspeaks between CH(2) and NH2(6) as well as the denaturating influence of urea in the UV melting experiment of (dd Aö)2. In addition, the detected difference in the chemical shift of the amino protons in dd A3 and dd Aö may suggest a base pairing. Antlparallelism of (dda^: As experiments with intramolecularly connected dd A Strands 36 demonstrate, (dd An)2 antiparallel AApairing is thermodynamically more stable than parallel. Therefore antiparallel Single Strands are postulated in (dd Aö)2 This postulate agrees with the expectation based on modeis of (dd Aö)2 and with the determined antiparallelism of other HomoDNA duplexes observed by H.J. Roth (16) and J. Hunziker (17). Mode of base palring: As a consequence of the conformation of the sugar phosphate backbone, the anti conformation of the glycosidic bond, and the antiparallelism of the Single Strands the only possible modes of base pairing in the model are WatsonCrick Hoogsteenlike base pairing or AA imino pairing. Results of melting experiments of dd lcontaining (by U. Diederichsen (81)) and of dd G containing oligonucleotides (by J. Hunziker (17)) lead to the conclusion that there is no AA imino pairing in (dd Aö)2 Therefore, we postulate for (dd Aö)2 WatsonCrickHoogsteenlike base pairs. Crystalizatlon experiments: Crystalizatlon experiments of dd An, n 2 = 6, yielded crystals too small for Xray analysis, however the crystal

9 XVI structure of dd A was determined (P2i2i2i). In this crystal the nucleosides were connected by WatsonCrickHoogsteenlike base pairs forming ribbon like structures. Melting process: UV, CD und NMRspectroscopic experiments indicate that dd A oligonucleotides with small mononucleotide numbers (n 2 = or 3) represent the unpaired state of dd Aö. Thus, according to NMR spectroscopic investigations that determined the conformation of dd A2, it is expected that the sugar phosphate backbone conformations of the paired and unpaired state of dd Aö belong to the same type, i e. the unpaired Strand is in a conformation preorganised for pairing. Corresponding to this hypothesis, the selfpairing of dd Aö is entropically more favored relative to DNA oligonucleotides. Furthermore, UV melting experiments demonstrate selfpairing for dd An, n > 3. Following the same procedures as for the Dconfigured dd A nucleotides, the Lconfigured dd A nucleotides L14 and L17, as well as Ldd Aö were synthesized starting from L6 (16). Neither the UV spectroscopically observed pairing experiments nor 'HNMR experiments of the racemic mixture of Ddd Aö and Ldd Aö indicate a racemic pairing.