5,6- Carboxy- Rhodamin (Rox) TIB MolBiol, Berlin Desoxynukleosidtriphosphat (dntp)
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- Kasimir Schuster
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1 8 Anhang 8.1 Chemikalien und Reagenzien Bromphenolblau Bromma, Schweden 5,6- Carboxy- Rhodamin (Rox) TIB MolBiol, Berlin Desoxynukleosidtriphosphat (dntp) Invitrogen TM, Karlsruhe Ethanol (RNase-frei) Carl Roth, Karlsruhe Essigsäure (Eisessig) Ethidiumbromid Serva, Heidelberg Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Sigma, Deisenhofen Glycerin Carl Roth, Karlsruhe Kaliumchlorid Magnesiumchlorid Invitrogen TM, Karlsruhe NaOH Natriumchlorid Molekulargewichts-Standards Gibco BRL, Eggenstein und Fermentas, St. Leon-Rot Platinum Taq DNA- Polymerase Invitrogen TM, Karlsruhe Primer, Sonden TIB Molbiol, Berlin Tris-HCl 8.2 Puffer und Lösungen PBS-Puffer ohne (Phosphat-buffered saline) 8,0 g NaCl 0,2 g KCl 1,44 g Na 2 HPO 4 0,24 g KH 2 PO 4 ad 1l Aqua bidest. ph 7,2 TAE-Puffer (50x) 242 g Tris- HCl 57,1 ml Eisessig 100 ml 0,5 M EDTA 71
2 ad 1 l Aqua bidest. ph 8 Ethidiumbromidlösung 10 mg/ml Ladepuffer (6x) für Gelelektrophorese 10 mm Tris-HCl, ph 7,5 2 mm EDTA 15% (v/v) Glycerin 0,1% Bromphenolblau 10 x NH 4 -PCR-Puffer Invitek, Berlin 8.3 Technische Geräte CO 2 Inkubator MCO-20AIC Digitalkamera Power Shot A95 Gelelektrophorese Ampergerät ST 304 Lichtmikroskop ID 03 Mikrowelle Privileg 8520 Pipettboy Pipetten Pipetus -akku Sicherheitswerkbank HERA Safe Vortexer Typ REAX 2000 Zentrifugen Laborzentrifuge Labofuge 400e Laborzentrifuge Heraeus Sepatech Laborzentrifuge Centrifuge 5402 PA Tischzentrifuge Centrifuge 5415D Zykler Gene Amp PCR- System 9700 Sanyo, Japan Canon, Amsterdam Gibco BRL, Eggenstein Zeiss, Oberkochen Privileg, Fürth Tec No Mara AG, Zürich Gilson Abimed Analysen Technik, Langenfeld Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt Heraeus, Hanau Heidolph, München Heraus, Hanau Heraeus, Hanau 8.4 Verbrauchsmaterialien Cryo Tubes (1, 2 ml) Falconröhrchen (15 ml, 50 ml) Nunc TM, Wiesbaden TPP, Schweiz 72
3 Lochplatten für TaqMan- PCR (96 Well) Optical Adhesive Covers Optical Tubes und Caps für TaqMan- PCR Parafilm American National Can, USA Pipetten für Zellkultur (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml) Nunc TM, Wiesbaden Pipettenspitzen Reaktionsgefäße (0,5 ml, 1,5 ml, 2 ml) Reaktionsgefäße (0,2 ml) Rapidozym GmbH, Luckenwalde 6,- 24-, 96- Well-Platten TPP, Schweiz Skalpell Carl Roth, Karlsruhe Zellkulturflaschen Nunclon (25 cm 2,75 cm 2, 175 cm 2 ) Nunc TM, Wiesbaden 8.5 Protokolle für die Histologie Hämalaun & Eosin-Färbung 1. Entparaffinierung und Rehydratisierung: 5 min 100%iger Alkohol: 96%iger Alkohol: 70%iger Alkohol: 1 min Aqua dest.: 1 min 2. Zur Kernfärbung: Hämalaun nach Mayer () für 3. Zum Bläuen 10 min fließend wässern. 4. Zur Gegenfärbung: wäßriges Eosin für 5 min. 5. Fließend wässern für 5 s. 6. Entwässerung in der aufsteigenden Alkoholreihe: 70%iger Alkohol : 1 min 100%iger Alkohol: 1 min 73
4 100%iger Alkohol: 1 min 7. Eindecken in Eukitt (Kindler, Freiburg) Giemsafärbung 1. Entparaffinierung und Rehydratisierung (siehe 8.5.1) 2. Giemsalösung für 25 min. 3. Aqua dest. für wenige s. 4. Differenzieren in 0,5%iger Essigsäure bis ein rötlicher Schimmer entsteht %iger Alkohol für wenige s. 6. Isopropanol: 5 min Isopropanol: 5 min 7. 5 min 8. Eindecken in Eukitt (Kindler, Freiburg) Periodic-Acid-Schiff-Reaktion 1. Entparaffinierung und Rehydratisierung (siehe 8.5.1) 2. 0,5%ige Perjodsäure für 10 min. 3. Aqua dest. fließend für 10 min. 4. Schiff's Reagenz für 15 min. 5. Aqua dest. für wenige s. 6. Leitungswasser fließend für 10 min. 7. Zur Gegnfärbung: Hämalaun nach Mayer für 30 s. 8. Zum Bläuen: Leitungswasser für 10 min. 9. Entwässerung in der aufsteigenden Alkoholreihe: 70%iger Alkohol : 1 min 100%iger Alkohol: 1 min 100%iger Alkohol: 1 min 74
5 10. Eindecken in Eukitt (Kindler, Freiburg) Ziehl-Neelsen-Färbung 1. Entparaffinierung und Rehydratisierung (siehe 8.5.1) 2. Hämalaun nach Mayer für min. 3. Leitungswasser fließend für 30 min. 4. Karbolfuchsin bei 37 C für min 5. Entfärben in Salzsäure-Alkohol (100 ml 70%iger Alkohol + 0,25 ml Salzsäure) bis keine Schlieren mehr abgehen %iger Alkohol für Wässern in Leitungswasser für 30 min. 8. Aufsteigende Alkoholreihe: 50%iger Alkohol: 45 s 70%iger Alkohol : 45 s 9. Eindecken in Eukitt (Kindler, Freiburg) Berliner-Blau-Färbung (Eisennachweis nach Perls) 1. Entparaffinieren in Aqua dest. 2. Kaliumferrozyanit 10% für 5 min. 3. Salzsäure 20% und Kaliumferrozyanit 20% 1:1 für 30 min x in Aqua dest. spülen. 5. Kernfärbung mit Kernechtrot für 5 min x in Aqua dest. spülen. 7. Entwässerung in der aufsteigenden Alkoholreihe: 70%iger Alkohol : 1 min 100%iger Alkohol: 1 min 75
6 100%iger Alkohol: 1 min 8. Eindecken in Eukitt (Kindler, Freiburg) 76
3,58 g 0,136 g. ad 100 ml
9 Anhang 9.1 Rezepturen der Puffer und Lösungen 9.1.1 Vorbereitung der Proben zur Extraktion Coon s-puffer (0,1 M, ph 7,2-7,6) Na 2 HPO 4 x 12 H 2 O KH 2 PO 4 Aqua dest. 3,58 g 0,136 g 8,77 g 9.1.2 Aufbereitung
Anlagen. Chemikalien. Ethidiumbromid/Acridinorange - Färbelösung:
92 Anlagen Chemikalien Ethidiumbromid/Acridinorange - Färbelösung: 1.1 Stammlösung: 50 mg Ethidiumbromid (No. 11615, Merck, Darmstadt), 15 mg Acridinorange (No. 15931, Merck, Darmstadt), 49 ml 10% EDTA-Lösung
Artikel.Nr. Artikel.Bez. VK Süsse
10153.00250 Bouin sche Lösung 15,12 10153.00500 Bouin sche Lösung 23,13 10153.01000 Bouin sche Lösung 44,95 10153.02500 Bouin sche Lösung 85,92 10177.00250 Färbelösung Eosin 1%, wässrig 7,87 10177.00500
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