Aus der Medizinischen Universitätsklinik - Abteilung Innere Medizin IV - der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau

Transkript

1 I Aus der Medizinischen Universitätsklinik - Abteilung Innere Medizin IV - der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Das Phäochromozyttom beii Neurofiibromattose Typ 1 Klliiniik und Mollekullargenettiik INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Vorgelegt 2005 von Tomas Harenberg geboren in Heidelberg

2 II Dekan Prof. Dr. R. Korinthenberg 1. Gutachter Prof. Dr. med. H.P.H. Neumann 2. Gutachter Prof. Dr. med. Ch. Bode Promotionsjahr 2006

3 III Meinen Eltern Anna und Job Meinem Bruder Daniel

4 IV Inhalt Abkürzungen Vorbemerkung V VI 1 Einleitung Geschichte des Phäochromozytoms und der Neurofibromatose Typ Das Phäochromozytom Die Neurofibromatose Typ Genetische Grundlagen Fragestellung 14 2 Patientengut und Methoden Patientengut Methoden 16 3 Ergebnisse Patientenfallbeschreibungen Zusammenfassung der klinischen Daten Mutationen des NF1-Gens Tabellarische Zusammenfassung der Mutationen Tabellarische Zusammenfassung der Polymorphismen Diskussion Klinische Ergebnisse Molekulargenetische Ergebnisse Zusammenfassung Literaturverzeichnis Danksagung Curriculum vitae 133

5 V Abkürzungen A Adrenalin bp Basenpaare CT Computertomografie - Röntgenologisches Verfahren zur Erstellung von del Deletion DHPLC Denaturing High Performance Liquid Chromatography DNA Desoxyribonuclein Acid (Säure) DOPA Dihydroxyphenylalanin EDTA Ethylendiamin-Tetraessigsäure GAP GTPase-activating protein GDP Guanosindiphosphat GRD GAP-related Domain GTP Guanosintriphosphat ins Insertion M Metanephrine MAPK Mitogen-activated protein kinase MEN 2 Multiple Endokrine Neoplasie Typ 2 MIBG Metaiodobenzylguanidin MRT Magnetresonanztomografie; Bildgebungsverfahren auf dem Prinzip der magnetischen Kernresonanz, ohne ionisierende Strahlen NA Noradrenalin NF1 Neurofibromatose Typ 1 NM Normetanephrine PCR Polymerase chain reaction (Polymerasekettenreaktion) PET Positronenemissionstomographie PGL Paragangliom-Syndrom RET Rearranged during transfection RNA Ribonuclein Acid (Säure) SDH Succinatdehydrogenase Taq Thermus aquaticus, Enzym für die PCR VHL Von-Hippel-Lindau

6 VI Vorbemerkung Das Phäochromozytom ist ein Tumor des Nebennierenmarkes, der sporadisch oder familiär auftritt. Die klinische und molekulargenetische Klassifikation der Phäochromozytome ist das langjährige Forschungsschwerpunkt der Freiburger Arbeitsgruppe von Prof. Neumann. In diesem Rahmen sind bereits Publikationen zum von Hippel-Lindau Syndrom, zur Multiplen Endokrinen Neoplasie Typ 2 und den Paragangliom-Syndromen 1-4 (Neumann et al. 2002A; Neumann et al. 2004) erschienen. Die Freiburger Gruppe hat daraufhin mit der klinischen und molekulargenetischen Charakterisierung der Phäochromozytome bei Neurofibromatose Typ 1 begonnen. Ursache der Krankheit ist eine Funktionsstörung des Proteins Neurofibromin. Das kodierende Gen ist das NF1-Gen auf Chromosom 17q11.2. Es ist ein Tumorsuppressorgen. Kooperationen bestanden mit dem Team von Herrn Prof. Opocher, Università degli Studi di Padova, Padua, Italien und dem Team von Herrn Prof. Januszewicz, Institute of Cardiology, Warschau, Polen. Innerhalb des Freiburger Labors erfolgte eine personelle Aufteilung der Analysen des NF1-Gens. Die Sequenzierung der Exons 1-8 und 28-49, d.h. von 30 der 57 Exons wurde vom Verfasser im Rahmen eines 10 monatigen Studienaufenthaltes bis 2004 an der Università degli Studi di Padova im Labor von Prof. Opocher begonnen und weitestgehend durchgeführt aber nicht beendet. Laborleiterin war Frau Dr. Schiavi. Die Untersuchung des kompletten NF1-Gens mittels der Denaturing High Performance Liquid Chromatography (DHPLC) und die Sequenzierung aller mittels dieser Methode als auffällig gefundener Exons wurde von Frau Dr. Bausch im Freiburger Labor etabliert und geleitet. In der Freiburger Arbeitsgruppe haben weiterhin Frau Buchta (MTA), Frau Bacher (MTA) und Herr Berisha (Hilfslaborant) am NF1-Projekt gearbeitet. Die in der DHPLC-Analyse auffälligen Proben wurden zum Sequenzieren in das Labor der Core Facility (Leiter: Dr. M. Hoffmann) der Medizinischen Universitätsklinik Freiburg gegeben und von Frau Dr. Bausch ausgewertet. Alle in dieser Arbeit abgebildeten molekulargenetischen Befunde, d.h. alle Mutationen wurden von Frau Dr. Bausch entdeckt. 6 Mutationen konnten durch die Sequenzierungen aus Padua bestätigt werden. Die klinischen Daten wurden im wesentlichen von Herrn Prof. Neumann und dem Verfasser der Arbeit mit den unmittelbar die Patienten betreuenden, ausserhalb Freiburgs tätigen Kollegen zusammengestellt. Die Auswertung der klinischen Daten bis Mai 2005 erfolgten von dem Verfasser der Arbeit.

7 1 1 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Geschichte des Phäochromozytoms und der Neurofibromatose Typ 1 Der Begriff Phäochromozytom setzt sich aus dem griechischen Wort "phaios", das "grau" bedeutet, sowie den Wortteilen "chrom-" für "Farbe", "zyt" für "Zelle" und der Endung "-om" für "Geschwulst" zusammen. "Phäo-chromo-zyt-om" bedeutet also, wörtlich übersetzt, "graufarbene Zellgeschwulst". Der Begriff Phäochromozytom geht auf den Berliner Pathologen Ludwig Pick ( ) zurück, der Bezug auf die dunkelbraune Farbe der Zellen bei Kontakt mit Chromsalzen nimmt (Pick, 1912). Der erste Fall eines Phäochromozytoms wurde von Fränkel 1886 als Ein Fall von doppelseitigem, völlig latent verlaufenen Nebennierentumor und gleichzeitiger Nephritis mit Veränderungen am Zirkulationsapparat und Retinitis beschrieben (Fraenkel, 1886). Die erste Verbindung von Phäochromozytom mit Neurofibromatose hatte 1910 Suzuki dargestellt (Suzuki, 1910), während die Koinzidenz mit anderen endokrinen Tumoren 1932 erstmalig von Eisenberg und Wallerstein erwähnt wurde (Eisenberg et al. 1932). Glushien et al. beschrieben 1953 eine familiäre Häufung der Erkrankung im Rahmen von Phakomatosen wie der Tuberösen Sklerose, dem Sturge- Weber- und besonders dem von Hippel- Abb. 1: Friedrich von Recklinghausen. Lindau-Syndrom (VHL) (Glushien et al. 1953) und der Neurofibromatose Typ 1 (M. Recklinghausen). Dieser Zusammenhang erklärt sich durch den gemeinsamen neuroektodermalen Ursprung der chromaffinen Zellen und der oben genannten Syndrome und deren Tumoren. Friedrich von Recklinghausen ( ) (Abb. 1), Pathologe in Würzburg, gilt als der

8 1 Einleitung 2 Erstbeschreiber der Neurofibromatose Typ 1 (NF1) erschien seine klassische Publikation "Über die multiplen Fibrome der Haut und ihre Beziehung zu den multiplen Neuromen", in welcher er den später benannten "Morbus Recklinghausen" detailliert an Hand der Autopsiebefunde zweier Patienten beschrieb ( von Recklinghausen, 1882). Zeichnungen und Beschreibungen der Krankheit lassen sich allerdings schon zu früheren Zeiten finden, so malte Aldrovandi 1642 ein vermutliches NF-Abbild, das später als monstrorum historica (Abb.2) bekannt wurde (Zanca et al. 1975). Abb. 2: Aldrovandis monstrorum historica, Opera Omnia. Bononiae, 1642

9 3 1 Einleitung 1773 beschrieb Tilesius einen Patienten mit multiplen fibrösen Hauttumoren, Café-au-lait Flecken, Makrozephalie und Skoliose (Abb.3) (Ruggieri und Pulizzi 2003). Grossen Verdienst an der Charakterisierung der Krankheit hatte auch der Lehrer Recklinghausens, Rudolf Virchow ( ), der von eine Reihe von klinischen und neuropathologischen Eigenschaften von Neuromen und Fibromen aufzeichnete und sogar Erblichkeit erkannte (Virchow, 1863): Ein ausgezeichneter Fall dieser Art gab mir Gelegenheit, die Einzelheiten genau zu verfolgen. Eine 47jährige Frau trug auf ihrem gamzen Körper zerstreut eine grosse Masse kleinerer und grösserer Gewächse, welche sich seit Jahren langsam entwickelt hatten. Viele von ihnen waren ganz klein, erbsen- bis kirschkerngross, rund und von glatter Haut bedeckt; andere waren grösser, wallnussgross und darüber, übrigens von gleicher Beschaffenheit. Der grösste sass links in der unteren Rippengegend mit breiter Basis auf; es hatte 48 Zoll im Umfang und erstreckte sich von der Linea alba bis etwa 2 Zoll vom Rückgraht. Es hing von da tief nach unten über die Hüfte herab. An seiner Oberfläche und in seinem Umfange trug es mehrere kleine Secundärknoten; im Ganzen war die es bedeckende Haut aber glatt und verhältnissmässig dünn. Dabei fühlte es sich weich, fast fluktuierend an. Nachdem es [.] extirpiert war, wog es 32½ Pfund. Neun Jahre fürher war es Kindskopfgross gewesen. [.] Diese Vorstellung wird noch mehr dadurch begünstigt, dass Fälle von ausgemachter erblicher Übertragung fibromatöser Dispositionen vorkommen. Ich habe einen jungen Mann gesehen, dessen Körper ganz übersäet war mit Knoten von der Grösse eines Stecknadelknopfs bis zu der von Taubeneiern, und in dessen Familie diese Besonderheit schon in der Dritten Generation in erblicher Weise vorhanden war. Abb. 3: the wart man, Tilesius von Tilenau : Historia Pathologica Singularis Cutis Turpitudinis Leipzig, Germany, Im Folgenden werden die klinischen und molekulargenetischen Grundlagen des Phäochromozytoms und der Neurofibromatose Typ 1 erläutert.

10 1 Einleitung Das Phäochromozytom Klinik Phäochromozytome sind neuroendokrine Tumoren aus chromaffinen Zellen des Nebennierenmarkes, die Katecholamine - vor allem Noradrenalin und Adrenalin - produzieren und sezernieren. Die 10% Regel (10% extraadrenal, 10% bilateral, 10% maligne, 10% hereditär, Manger und Gifford, 1993) wurde allerdings inzwischen weitgehend widerlegt: Die meisten Phäochromozytome kommen zwar sporadisch und unilateral vor, aber 24 % sind familiär (Neumann et al. 2002A). Maligne Entartung kommt selten vor (10%). Häufigste Lokalisation der Metastasen sind Lunge, Leber und Knochen. Bei adulten Patienten liegen etwa 10% der Phäochromozytome extraadrenal (Neumann et al. 1993) und werden in der Regel von Pathologen als Paragangliome bezeichnet. Paragangliome stammen aus den hauptsächlich retroperitoneal gelegenen Paraganglien des sympathischen Systems. Sie können aber auch in chromaffin negativen Zellen lokalisiert sein und dem parasympatischen System angehören (Neumann et al. 2002A). Paragangliome liegen am häufigsten paraaortal (75%), kommen aber auch in der Blase (10%), dem Thorax (10%), dem Kopf-, Nackenbereich (3%) und im Becken (2%) vor (Kaltsas et al. 2004). Sie können hormonaktiv und hormoninaktiv sein. Das Symptomenspektrum unterscheidet sich nicht von dem des Phäochromozytoms. Am häufigsten äußern sich Phäochromozytome mit einer klassischen Trias bestehend aus Kopfschmerzen, Palpitationen und Schweißausbrüchen. Andere Symptome sind Hypertonie, Blässe, psychische Störungen, Schmerzen und Übelkeit (Kaltsas et al. 2004). Differentialdiagnostisch kommen Angsterkrankungen, Schilddrüsenüberfunktion (Hyperthyreose), Kopfschmerzen anderer Genese, Alkoholentzugssymptomatik sowie andere sekundäre Hypertonieformen wie Hypercortisolismus, Nierenarterienstenose und Conn- Syndrom (Hyperaldosteronismus) in Betracht Diagnostik und Therapie Bei klinischer Indikation sollte als Screeningverfahren eine Adrenalin-, Noradrenalin-, Metanephrin-, Normetanephrin- und Vanillinmandelsäurebestimmung im 24h-Urin, oder eine Adrenalin- und Noradrenalinbestimmung im Plasma erfolgen, um einen Hinweis auf evtl. erhöhte Katecholaminwerte zu erhalten (Eisenhofer et al. 2004). Im Plasma kann ein erhöhter Noradrenalin-Ruhewert auf ein Phäochromozytom hinweisen. Als radiologische bildgebende

11 5 1 Einleitung Verfahren stehen Ultraschallsonographie, Computertomographie (CT), Magnetresonanztomographie (MRT), 123-Jod oder 131-Jod-Metaiodobenzylguanidin (MIBG)- Szintigraphie und die 18-Fluor-DOPA-Positronenemissionstomographie (DOPA- PET) zur Verfügung. Die Sonographie ist trotz verbesserter Technik ungenau und erfordert einen versierten Untersucher. Die MRT ist der CT hinsichtlich der Sensitivität um ca. 15% überlegen. Sie erlaubt aufgrund der multiplanaren Schnittführung eine optimale Darstellung des Retroperitoneums, wo ca. 99% der Phäochromozytome lokalisiert sind. Die MIBG- Szintigraphie (Van Gils et al. 1990; Campbell et al. 1996) nutzt den Katecholaminmetabolismus zum Uptake innerhalb 48 Stunden und hat eine Sensitivität von ca. 85 bis 97%. Bei der 18-Fluor- DOPA-Positronenemissionstomographie (PET) wird eine hochauflösende Bildgebung mit der Aufnahme des Radiopharmakons kombiniert. Nach einer Pilotstudie von Högerle et. al. (2002) ist die 18-Fluor-DOPA-PET mit einer Sensitivität und Spezifität von 100% der MRT gleichwertig und allen anderen Verfahren überlegen. Die derzeit zu empfehlenden Nachweisverfahren sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Tab. 1: Sensitivität und Spezifität verschiedener Untersuchungen zur Diagnostik des Phäochromozytoms Untersuchung Sensitivität Untersuchung Sensitivität Adrenalin/Noradrenalin im Plasma 33%/58% Sonographie 40% Adrenalin im Urin 53% CT 76% Vanillinmandelsäure im Urin 64% MRT 95% Noradrenalin im 24h-Urin 86% MIBG-Szintigramm 95% Metanephrin/Normetanephrin im Urin 97% 18-Fluor-DOPA-PET 100% Angaben nach Neumann et al. (1993), Eisenhofer et al. (1999), Högerle et al. (2002), Lenders et al. (2002) Nach der bildgebenden und biochemischen Sicherung der Diagnose ist die Therapie der Wahl bei Phäochromozytomen die laparoskopische organerhaltende Operation. Als präoperative Medikation wird α- und β-blockade mit Phenoxybenzamin und Metoprolol empfohlen (Neumann et al. 2002B). Die Behandlung maligner Phäochromozytome ist schwierig. Die Therapieoptionen sind Resektion, Chemotherapie (Averbuch et al. 1988), die Jod-131-MIBG in hoher Dosierung oder Oktreotid-Analoga sowie α-blocker. Kriterien für ein Ansprechen der Therapie sind Reduktion von Tumorgewebe, Senkung des Blutdrucks, der Katecholamine, und der bestehenden Symptome.

12 1 Einleitung Molekulargenetische Klassifikation Anders als bisher angenommen, sind mehr als 10% der Phäochromozytome hereditär. Zu den Tumorsyndromen, bei denen ein Phäochromozytom vorkommt, gehören: Die multiple endokrine Neoplasie Typ 2 (MEN 2), ein autosomal dominantes Syndrom, das in drei Subtypen unterteilt werden kann, MEN 2A, MEN 2B und das familiäre medulläre Schilddrüsenkarzinom. Die Häufigkeit wird auf 1: geschätzt. Ca. 50% der MEN 2A und MEN 2B Patienten entwickeln ein Phäochromozytom, wobei sie auch multifokal und bilateral vorkommen. Ursache der Erkrankung sind Mutationen des RET-Protoonkogens auf Chromosom 10q11.2 (Neumann et al. 2002A). Das von Hippel-Lindau Syndrom (VHL), ebenfalls autosomal dominant, kann in zwei Subtypen unterteilt werden: VHL Typ 1 (ohne Phäochromozytom) und VHL Typ 2 (mit Phäochromozytom). Die Prävalenz wird zwischen 1: und 1: angegeben % der VHL Patienten entwickeln ein Phäochromozytom, bis zu 50% sind multifokal und/oder bilateral. Ursache sind Mutationen des VHL-Tumorsuppressorgens auf Chromosom 3p25-26 (Gimm et al.2004). Hereditäre Phäochromozytome und Paragangliome, deren genetische Ursachen erst seit 2000 mit den SDHx Genen (Succinatdehydrogenase) entdeckt wurden. Die Paragangliom-Syndrome unterteilen sich in 4 Entitäten. Das PGL 1 Syndrom bedingt durch Mutationen des SDHD-Gens (Chromosom 11q23), das PGL 2 Syndrom, das im Zusammenhang mit Veränderungen im chromosomalen Bereich 11q13 steht, das PGL 3 Syndrom, bedingt durch Mutationen des SDHC-Gens (1q21) und das PGL 4 Syndrom, dessen genetische Ursache Mutationen des SDHB-Gens (1p36-1p35) sind. Im Zusammenhang mit dem PGL 3 Syndrom spricht man nicht von Phäochromozytomen sondern von HNPs ( Head and Neck-Paragangliomas ). Mutationsanalysen ergaben bisher nur relevante Ergebnisse für SDHB und SDHD (Neumann et al. 2002A). Die Neurofibromatose Typ 1 (Morbus von Recklinghausen) mit einer Prävalenz von 1:3500. Die Inzidenz von Phäochromozytomen wird von 0,1 5,7 % in vivo und bis zu 13% bei Autopsie angegeben (Walther et al. 1999A) (Tab. 2). Für die Krankheit sind Mutationen des NF1-Tumorsuppresorgens verantwortlich.

13 7 1 Einleitung 1.3 Die Neurofibromatose Typ Klinik, Diagnostik und Therapie Die Neurofibromatose Typ 1 ist eine autosomal dominante Krankheit, deren Inzidenz bei 1:3500 Lebendgeburten liegt (Huson et al. 1994). Die eine Hälfte der Fälle kommt familiär vor, die andere Hälfte ist sporadisch. Die Penetranz beträgt bei sehr variablen klinischen Erscheinungsbildern annähernd 100%. Für die Diagnose müssen die Patienten mindestens zwei der folgenden Merkmale aufweisen (Stumpf et al. 1988; Gutmann et al. 1997): 6 oder mehr so genannte Café-au-lait Flecken, hellbraune Hautflecken, die präpubertal eine Größe von mindestens 5 mm, postpubertal über 15 mm aufweisen können. 95% der Patienten bilden Café-au-lait Flecken (Abb. 4a). 2 oder mehr Neurofibrome, meist gutartige Geschwülste, die klinisch und histologisch in drei Typen unterteilt werden können: 1. Kutane Neurofibrome, benigne Tumoren in der Haut (Abb. 4b). 2. Noduläre Neurofibrome in peripheren Nerven, ubiquitär auftretend und nicht infiltrierend. 3. Plexiforme (netzartig wachsende) Neurofibrome (ca. 30 % der Patienten), die bei maligner Entartung die häufigste Todesursache der NF1 darstellen. Sommersprossenartige Pigmentierung der Achselhöhlen und/oder der Leistengegend ( Axillary Freckling, Inguinal Freckling, Abb. 4c). Ein Optikusgliom, ein Tumor am Sehnerv. Mindestens 2 Irishamartome, so genannte Lisch-Knoten, die sich als Pigmentanreicherungen auf der Regenbogenhaut des Auges äußern (Abb. 4d). Eine ausgeprägte Knochendysplasie des Sphenoids und/oder der langen Röhrenknochen. Mindestens ein Verwandter ersten Grades mit der Diagnose Neurofibromatose Typ 1.

14 1 Einleitung 8 a) b) c) d) Abb. 4 a-d: Typischsten Symptome der Neurofibromatose: a) Café-au-lait Fleck, Quelle: Internet b) Fibrome der Haut, Quelle: Internet. c) Freckling, axillär (wie in diesem Fall) oder inguinal, Quelle: Internet. d) Lisch-Knoten der Iris Quelle: Internet. Weitere klinische Symptome, die gehäuft bei Neurofibromatose Typ 1 auftreten, sind Skoliosen, mentale Retardierung mit Lern-, Leistungs- und Verhaltensstörungen, Minderwuchs, Makrozephalie, Hydrozephalus, Epilepsie, Hypertonie sowie Kopfschmerzen. Vermehrt treten auch Tumoren im Intestinum, maligne Gliome, juvenile chronische myeloische Leukämie und das Phäochromozytom auf (Hirsch et al. 2001). Eine ursächliche Therapie der Krankheit ist nicht möglich. Somit steht die symptomatische Behandlung im Vordergrund. Es können z.b. Neurofibrome der Haut laserchirurgisch auch in großer Zahl entfernt werden. Die Neurofibromatose Typ 1 erfordert eine Betreuung durch verschiedene Fachdisziplinen, wie durch Dermatologie, Genetik, Pädiatrie, Neurochirurgie, Orthopädie, etc.. Dies ist am besten in einem Neurofibromatose-Zentrum gewährleistet.

15 9 1 Einleitung Molekulargenetik des NF1-Gens Das NF1-Gen (Abb. 5) wurde erst Anfang der 90er Jahre identifiziert (Cawthon et al. 1990, Viskochil et al. 1990). Es ist auf Chromosom 17q11.2 lokalisiert. Es ist mehr als 300 kb groß und besteht aus 60 Exons. Das mrna-transkript ist 8454 Basen lang. Sie werden zu 2818 Aminosäuren translatiert. Das Produkt ist das Protein Neurofibromin (Li et al. 1992). Es gehört zur Gruppe der Abb. 5: 3D-Struktur des Neurofibromins (aus Tumorsuppressorgene (DeClue et al. 1992; Li et al. 1995). Eine im Protein zentral gelegene, 360 Aminosäuren lange Region zeigt dabei eine signifikante Ähnlichkeit mit der katalytischen Domäne des Ras GTPase-aktivierenden Proteins (p120gap) der Säugetiere. Diese GAP-related Domain (GRD) interagiert mit Ras und führt zur Hydrolyse des an Ras gebundenen aktiven GTP (Guanosintriphosphat) zum inaktiven GDP (Guanosindiphosphat) (Abb.6) (Xu et al. 1990; Feldkamp et al. 1999). Dadurch wird der klassische MAP-Kinase-Signaltransduktionsweg (Abb.7) und die daraus Abb. 6: Schematiche Darstellung des NF1-Gens, des mrna Transkripts und des Proteinproduktes, dem Neurofibromin. Das NF1-Gen ist 350 kb, die mrna 8-9 kb lang. Das große Protein Neurofibromin hat ein Molekulargewicht von 220 kda. Blau markiert ist die GAP-related-Domain = GRD, nach Feldkamp et al. (1999).

16 1 Einleitung 10 entstehende Zellproliferation unterbrochen. Mutationen führen zur gestörten Expression des Neurofibromins und somit zu verminderten Inhibierung der Zellteilung, woraus Tumoren entstehen können. Das Ras-Protein hat 21 kda und beeinflusst eine Reihe weiterer Mediatoren, meist Wachstumsfaktoren. Mutationen des Ras-Proteins sind bei 50% von Kolon-, 90% von Pankreas- und 25% von anderen bösartigen Tumoren beschrieben worden (Feldkamp et al. 1999). Abb. 7: Schematische Darstellung des Ras-Reaktionsweges. Ein Signalmolekül dockt an den Tyrosinkinaserezeptor an. Dessen Phosphorylisierung führt zur Bindung mehrerer Kinasen bis es zur Aktivierung des Ras-Proteins kommt. Über mehrere Phosphorylierungen kommt es dann zur Genexpression. Das Tumorsupressorgen Neurofibromin (NF) kann die Aktivierung des Ras-Proteins unterbinden. Verteilt im menschlichen Genom finden sich DNA-Sequenzen, die eine Homogenität von über 95% zu der NF1-Gensequenz aufweisen (Luijten et al. 2001). Diese so genannten Pseudogene spielen in der genetischen Untersuchung des NF1-Gens insofern eine Rolle, als dass ihre Amplifikation ausgeschlossen werden muss, um Fehldeutungen zu vermeiden. Diese Pseudogene können durch interchromosomale Konversion Ursprung mancher Mutationen im NF1-Gen sein (Marchuk et al. 1992). In der Tabelle 2 sind die bisher entdeckten Pseudogene aufgelistet.

17 11 1 Einleitung Tab. 2: Auflistung der bekannten Pseudogene. Accession Nr. bezieht sich auf die Datenbank des NCBI. Chromosom Exon(s) Accession Nr. Referenz 2 10b, 12a-19a, 27b AF AF Luijten et al b-19a, 27b AC The sanger centre* * Y07858 Regnier et al U35697 Purandare et al U35686 Purandare et al , 17 AC Birren et al. unpubliziert 14 10b, 12a-19a, 27b AF AF Luijten et al b, 12a-19a, 27b AF AF Luijten et al b, 12a-19a, 27b AF AF Luijten et al b, 12a-19a, 27b AF AF Luijten et al b, 12a-19a, 27b AL Genoscope** 14 12b-19a, 27b AL Genoscope** Y07854, Y07855 Regnier et al , 15, 16, 18 U35696, U35684, U35687, U35690 Purandare et al Y07856, Y07857 Regnier et al AF Kehrer-Sawatzki et al U35685 Purandare et al AF011746, AF Kehrer-Sawatzki et al U35691 Purandare et al b U35693 Purandare et al M84131 Legius et al AF Kehrer-Sawatzki et al U35694 Purandare et al U35695 Purandare et al AF011747, AF011745, AF Kehrer-Sawatzki et al b M84131 Legius et al , 24-27b AC021585, AC023191, AC Birren et al. unpubliziert , 24-27b AC Birren et al. unpubliziert b AC Birren et al. unpubliziert , 11 AP Hattori et al. unpubliziert 18 8 U35688 Purandare et al U35689 Purandare et al , 11 D26141, AC Suzuki et al b, 12a-19a, 27b AC002471, AC003064, AC Luijten et al Y07859 Regnier et al U35692 Purandare et al * = siehe Literaturverzeichnis, ** Genoscope, Centre National de Sequencage ( Tabelle nach Luijten et al. (2001).

18 1 Einleitung Genetische Grundlagen Transkription und Translation Die genomische DNA (gen. DNA) wird im Zellkern in die messenger RNA (mrna), auch codierende DNA (cdna) genannt, übersetzt. Sie ist die Grundlage der Aminosäuren und somit der Proteinsynthese. Dabei werden die Nukleotide Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) übernommen, Thymin (T) jedoch in Uracil (U) umgewandelt. Der genetische Code beinhaltet, dass von drei Nukleotiden (Codon) eine Abb. 8: Der genetische Code nach Bresch und Aminosäure codiert wird (Abb. 8). Der Hausmann veranschaulicht die Verschlüsselung der 20 verschiedenen Aminosäuren durch die Code ist universell, das heißt, er ist bei Basen der DNA. Das Triplett wird von innen nach außen gelesen. Bestimmte Dreierkombinationen Menschen, Tieren und Pflanzen von Basen signalisieren, wann die Proteinsynthese in den Ribosomen beginnen (Start-Codon) und identisch. Der Ausdruck degeneriert wann sie enden soll (Stopp-Codon). bedeutet, dass eine Aminosäure durch verschiedene Tripletts codiert werden kann. Die mrna wandert aus dem Zellkern zu den Ribosomen im Zellplasma und wird dort zu den Proteinen translatiert. Jedem Basen-Triplett wird eine Aminosäure zugeordnet. ATG codiert für das Start-Codon, somit beginnen alle Proteine mit der Aminosäure Methionin. Stopp-Codons (TGA, TAA, TAG) beenden die Proteinbiosynthese. Die 20 Aminosäuren sind in Tabelle 3 aufgelistet. Tab. 3: Abkürzungen der einzelnen Aminosäuren. Aminosäure 3-Buchstaben 1-Buchstaben 3-Buchstaben 1-Buchstaben Aminosäure Code Code Code Code 1. Alanin Ala A 11. Leucin Leu L 2. Arginin Arg R 12. Lysin Lys K 3. Asparagin Asp D 13. Methionin Met M 4. Asparaginsäure Asn N 14. Phenylalanin Phe F 5. Cytosin Cys C 15. Prolin Pro P 6. Glutamin Glu Q 16. Serin Ser S 7. Glutaminsäure Gln E 17. Threonin Thr T 8. Glycin Gly G 18. Tryptophan Trp W 9. Isoleucin Ile I 19. Tyrosin Tyr Y 10. Histidin His H 20. Valin Val V

19 13 1 Einleitung Bei Angabe von Mutationen können verschiedene Angaben gemacht werden: 1. Die Zahl nach Nukleotiden steht für die Position des Nukleotids, die Buchstaben für die Basen. Das Beispiel 1101 C/T bedeutet, dass im Nukleotid 1101 der codierenden DNA die Base Cytosin (C) durch die Base Thymin (T) ersetzt ist. 2. Die Zahl zwischen zwei Aminosäuren steht für die Codonnnummer. Der Buchstabe vor der Zahl steht für die Aminosäure in der Wildtypsequenz, der Buchstabe danach für die Aminosäure, die durch die Mutation resultiert. Im Beispiel der Mutation D112Y wird im Codon 112 die Aminosäure Asparagin (D) durch Tyrosin (Y) ersetzt. Alternativ kann auch die Aminosäure durch den dreibuchstabigen Code benannt werden (Asp 112 Tyr). 3. Handelt es sich bei der Mutation um eine Insertion oder Deletion von Basen, so führt dies zum so genannten Frameshift. Der Frameshift sagt aus, dass durch die Insertion oder die Deletion es zu einer Verschiebung des Leserasters kommt und die ursprüngliche Aminosäuresequenz nicht eingehalten wird. So werden falsche Aminosäuren übersetzt, bis es zu einem Stopp-Codon kommt. Bei Insertionen und Deletionen wird die Nukleotidnummer genannt, nach der es zu einer Baseninsertion oder deletion kommt. (z.b ins C oder 1507 del A). 4. Mutationen, die sich 2 Basen vor oder 2 Basen nach dem Exon befinden, betreffen die AG/GT-Regel. Die AG/GT-Regel besagt, dass Introns - die nicht codierenden Sequenzen zwischen zwei Exons am 5`Ende des Introns mit den Basen GT beginnen und mit der Basenfolge AG am 3`Ende des Introns enden (Breathnach et al. 1978; Mount SM, 1982). Bei der Darstellung dieser so genannten Splice site Mutationen wird entweder die Lokalisation des ersten Nukleotids des Exons genannt mit dem Zusatz -1 oder -2. Diese Angabe verdeutlicht die Entfernung zu dem Beginn des Exons. Bei einer Mutation im GT-Bereich nach dem Exon wird die Nukleotidnummer der letzten Base des Exons genannt. Es folgt der Zusatz +1 oder +2, um die genaue Position nach dem Exon anzugeben.

20 1 Einleitung Fragestellung Die Neurofibromatose Typ 1 ist eine häufige Erbkrankheit, die Assoziation mit Phäochromozytomen aber selten. Von zentralem Interesse war die Charakterisierung der zugrunde liegenden Mutationen bei Patienten, die beide Merkmale aufweisen. Im Verlaufe stellten sich zwei Herausforderungen: Zum einen erschien es wichtig, die Zielgruppe möglichst groß zu gestalten, um repräsentative Ergebnisse zu erzielen. Zum anderen waren erhebliche Probleme bei den DNA-Analysen zu lösen. Vor diesem Hintergrund lässt sich die Fragestellung wie folgt fassen: 1. Klinische Charakterisierung von NF1-assoziierten Phäochromozytomen: Wie ist das Spektrum hinsichtlich Alter, Geschlecht, Produktion/Elimination der Katecholamine, Lokalisation und Zahl der Tumoren sowie Vorkommen maligner Tumoren? 2. Unter welchen methodischen Voraussetzungen lassen sich Mutationen nachweisen und welche Sensitivität wird dabei erreicht? 3. Wie häufig kommen intraexonische Mutationen des NF1-Gens als Ursache vor? 4. Lassen sich genetische Besonderheiten hinsichtlich der Lokalisation im Gen oder dem Mutationstypus (Missense Mutationen versus Protein-verkürzende Mutationen) feststellen? 5. Lässt sich die Untersuchung des NF1-Gens kostengünstig und schnell als Routinediagnostik durchführen, und welche Konsequenz und welcher Nutzen ergibt sich daraus für den Patienten und deren Angehörige?

21 15 2 Patientengut und Methoden 2 Patientengut und Methoden 2.1 Patientengut Grundlage für das Patientengut ist das Freiburger Phäochromozytomregister. Zu diesem Register haben im Wesentlichen folgende Erhebungen beigetragen: 1. Epidemiologische Erfassung aller Phäochromozytome in Südwestdeutschland, schwerpunktmäßig prospektiv seit 1983 bis 2005 und retrospektiv bis Erfassung aller Phäochromozytome des Kindes- und Jugendalters in Deutschland, durchgeführt von 1998 bis Erfassung aller Patienten mit Phäochromozytomen in Zentral-Polen, durchgeführt von Prof. W. Januszewicz und von Prof. A. Januszewicz, Warschau. 4. Weiterhin wurden zahlreiche Phäochromozytom-Patienten als Einzelfälle und kleinere Serien, unter anderem von den deutschen Universitäten in Lübeck und Essen sowie von italienischen Universitäten in Padua und Rom gemeldet. Einzelne Fälle lieferten Nancy, London und Basel. Von allen Patienten wurden folgende Daten erhoben: Geburtsdatum Geschlecht OP-Datum Lokalisation und Größe des Tumors Multiple oder solitäre Tumoren Dignität der Tumoren Tumoren in anderen Organen Familienanamnese In dieser Arbeit wurden alle Patienten aus dem Freiburger Internationalen Phäochromozytomregister berücksichtigt, die eine Neurofibromatose Typ 1 und ein Phäochromozytom aufwiesen. Die Neurofibromatose Typ 1 wurde klinisch, das Phäochromozytom histologisch diagnostiziert. Die Registrierung war auf den limitiert. Von jedem Patienten musste Blut oder Blut-DNA verfügbar sein.

22 2 Patientengut und Methoden Methoden Die Exons 1-8 und wurden vom Verfasser in einem Labor in Kooperation mit Herrn Prof. Opocher der endokrinologischen Abteilung der Università degli Studi di Padova (Padua) in Italien während eines 10 monatigen Forschungsaufenthaltes sequenziert. Die Untersuchungen konnten allerdings nicht komplett abgeschlossen werden. Die DHPLC und die Sequenzierung der Exons mit auffälligen DHPLC-Diagrammen wurde im Labor von Herrn Prof. H.P.H. Neumann unter Leitung von Frau Dr. Bausch durchgeführt Klinische Kasuistikdarstellung Die vorhandenen Akten und Informationen wurden gesammelt und im Detail ausgewertet. Für alle Patienten wurde ein Fragebogen erstellt, mit dem folgende Informationen eingeholt wurden: 1. Allgemeine Patientendaten 2. Detaillierte Anamnese 3. Familienanamnese 4. Klinischer Untersuchungsbefund 5. Diagnostik a) 24h-Blutdruckmessung präoperativ b) Katecholaminuntersuchungen im 24h-Urin und im Plasma c) Bildgebende Befunde: Computertomogramm des Abdomens Kernspintomogramm des Abdomens MIBG-Szintigraphie DOPA-PET 6. Therapie 7. Postoperativer Verlauf Diese Erhebungen gestalteten sich mehrheitlich mühevoll, da die Akten in den primär betreuenden Krankenhäusern erneut eingesehen werden mussten. Für eine gute Darstellung der Fälle in der vorgelegten Arbeit wurden alle verfügbaren Abbildungen zusammengetragen, ausgewertet und auszugsweise wiedergegeben.

23 17 2 Patientengut und Methoden DNA-Extraktion aus EDTA-Blut Die DNA aus peripheren Blutleukozyten wurde mittels Extraktion durch Säulen von Qiagen (QIAamp DNA Blood Kit von Qiagen, Scherczinger et al. 1997) gewonnen. Das QIAamp DNA isolation blood kit beinhaltet verschiedene Puffer-Lösungen und eine Extraktionssäule. In ein 50 ml Falcon-Tube werden 5 ml EDTA antikoaguliertes Vollblut zu 5 ml eiskaltem Puffer C1 und 15 ml eiskaltem ddh 2 O gegeben und vorsichtig gemischt. Anschließend wird das Gemisch für 10 min auf Eis inkubiert. Die Lyse der Zellen erfolgt durch den Puffer C1, der Nukleus bleibt jedoch intakt. Das Lysat wird für 15 min bei 4 C und 2500 U/min zentrifugiert. Danach wird der Überstand verworfen. Das durch residuelles Hämoglobin rötlich gefärbte Pellet wird mit 1 ml eiskaltem Puffer C1 und 3 ml eiskaltem ddh 2 O resuspendiert und nochmals für 15 min bei 4 C und 2500 U/min zentrifugiert. Dadurch werden restliches Hämoglobin und weitere Zelltrümmer entfernt. Die Resuspension des weißen Pellets erfolgt durch Vortexen mit 5 ml Puffer G2. Darauf werden 95 μl Proteinase K- Lösung zugefügt und bei 50 C für 30 bis 60 min inkubiert. Der Puffer G2 bewirkt eine Lyse des Nukleus und eine Denaturierung von Proteinen, welche durch die Proteinase in kleinere Fragmente verdaut werden. Die Lösung sollte dabei klar werden, damit die mit Puffer QBT äquilibrierte Säule, auf die sie gegeben wird, nicht verstopft. Nachdem die Lösung die Säule passiert hat, werden 2 mal 7,5 ml Wasch-Puffer QC hinzugegeben. Durch 5 ml Eluierungs- Puffer wird die DNA von der Säule gelöst und mittels 3,5 ml Isopropanol präzipiert. Die DNA-Fäden können mit einer Pipettenspitze gefangen und in Tris-Borat-EDTA (TBE) gelöst werden Polymerasekettenreaktion (PCR) Einzelne spezifische DNA-Abschnitte können mittels PCR vervielfältigt werden. In mehreren Zyklen werden DNA-Einzelstrangabschnitte durch eine thermostabile DNA-Polymerase repliziert (Saiki et al. 1985). Jeder Zyklus besteht aus drei Teilschritten. Vor Beginn des ersten Zyklus erfolgt eine verlängerte Denaturierungsphase. Der erste der drei Teilschritte trennt nach jedem Zyklus die doppelsträngig vorliegende DNA in zwei Einzelstränge. Im zweiten Schritt folgt die Hybridisierung der Primer mit den DNA-Einzelsträngen. Jedes Primerpaar hat eine spezifische Annealing-Temperatur. Die beiden am 3` Ende zum Strang und Gegenstrang komplementären Primer-Oligonukleotide flankieren die zu replizierende DNA. Die kurzen Doppelstrangabschnitte, die von den Einzelsträngen und den daran gebundenen

24 2 Patientengut und Methoden 18 Primern beim Annealing gebildet werden, dienen als Ausgangspunkt für die Replikation durch die thermostabile Taq-Polymerase. Dies geschieht im dritten Teilschritt. Die Replikation des zwischen den beiden Primern vorliegenden DNA-Abschnittes erfolgt bei jedem Zyklus genau so oft, wie Strang und Gegenstrang vorliegen. Die sechzig Exons des NF1-Gens wurden mit den in der Tabelle 5 aufgelisteten Primerpaaren und Untersuchungsbedingungen untersucht. Um die Amplifikation der vielen Pseudogene zu verhindern, wurden die Primer mit dem Programm Primer Express von Applied Biosystems erstellt. Das Programm stellt den Primer so her, dass er am 3`-Terminus, eine Abweichung zu den Sequenzen der Pseudogene aufweist (so genannte Allelspezifische PCR, Abb. 9) (Newton et al. 1989). Dadurch kommt am Pseudogen eine Basenfehlpaarung am 3`-Terminus zustande, wodurch die Taq-Polymerase unter optimierten Reaktionsbedingungen am 3`-Terminus des Primers, der sich an das Pseudogen heftet, nicht anbinden kann und so zu einer allel-spezifischen Amplifikation führt (Ugozzoli et al,. 1991). Alle verwendeten Primer sind in Tabelle 4 aufgelistet. Abb. 9: Schematiche Darstellung des Funktionsprinzips einer Allel-spezifischen (AS) PCR. Der 3`-Terminus des Primers weist eine Base auf, die nur an die Wildtyp-Sequenz andockt. Somit kann die Polymerase am Pseudogen keine Amplifikation starten. Sind beide Pimer allelspezifisch, steigt die Spezifität des Produktes Agarosegelelektrophorese Die Agarosegelelektrophorese dient der Kontrolle von erfolgter Amplifikation. Zusätzlich kann mittels der Agarosegelelektrophorese die Größe der Amplifikationsprodukte der Polymerasekettenreaktion bestimmt werden. Bei der Herstellung wird Agarose in TBE-Puffer (Tris-Borat-EDTA) gelöst und aufgekocht. Nach Abkühlung wird die noch flüssige Gelmasse in ein Geltablett gegossen. Das Geltablett wird mit Kämmen bestückt, um die Ladetaschen im Gel zu bilden. Die DNA-Proben werden vor dem Auftrag auf das Gel mit Agarosegel- Ladepuffer versetzt. Das Füllen der Taschen erfolgt nach dem Einlegen des Gels in die mit TBE gefüllte horizontale Elektrophoresekammer. Zum Abschätzen der Länge und Konzentration der Nukleinsäuren, wird ebenso ein DNA-Längenstandard aufgetragen. Der

25 19 2 Patientengut und Methoden Längenstandard beinhaltet eine definierte Menge und definierte Größen von DNA. Die Auftrennungszeit beträgt im Schnitt 30 min bei 100 Volt. Dabei werden die Fragmente im elektrischen Feld entsprechend Größe und Ladung aufgetrennt. Durch Färben des Gels mittels einer Lösung, die fluoreszierendes Ethidiumbromid Abb. 10: Agarosegel mit aufgetragenem Marker V enthält, können die Fragmente unter in Spalte 1, sowie Exon 2,3,4b, 34 und in Spalten Leere Spalten enthalten als UV-Licht der Wellenlänge 366 nm Kontrolle Premix ohne DNA Zusatz. sichtbar gemacht, mit einer Polaroid- Kamera fotografiert und dokumentiert werden. Auf dem Agarosegel in Abbildung 10 erkennt man in der ersten Spalte den Längenmarker und in den folgenden Spalten die Produkte der Exons. Der aufgetragene Marker vom Typ V zeigt 3 Bandenpakete mit definierten Größen, die das Abschätzen der Produktgrößen erleichtert. Deren Längenunterschiede sind deutlich zu erkennen Sequenzierung in Italien Das PCR-Amplifikat wurde für die Sequenzierung (Sanger et al. 1977) anhand eines Agarosegels durch Vergleich an einer mit Marker gefüllten Tasche quantifiziert und anschließend diluiert, um die richtige Menge DNA für die Sequenzreaktion zu erhalten. Die Sequenzierreaktion fand in einem 10 μl Ansatz statt. Darin enthalten waren 1 μl Primer, 5 μl verdünntes Amplifikat und 4 μl Big Dye (Applied Biosystems). Sie lief über 25 Zyklen bei 3 Teilschritten. Nach der Denaturierung des Amplifikats bei 96 C folgt das Annealing des Primers bei 50 C. Die Sequenzreaktion findet bei 60 C statt. Nach Aufreinigung des Produktes durch Zentrifugieren auf CentriSep-Säulen, wurden die Ergebnisse der Sequenzier-PCR in einem benachbarten Labor mittels Elektrophorese untersucht und als ABI-Datei bereitgestellt. Diese wurden danach mit dem Programm MT- Navigator von Applied Biosystems bearbeitet.

26 2 Patientengut und Methoden 20 Tab. 4: Sequenz der verwendeten Primer. F steht für den Forward-Primer, R für den Reverse-Primer, MgCl 2 für die Magnesiumchlorid-Konzentration in mm. T A bezeichnet die Annealing Temperatur des jeweiligen Primers in C. Die drei Splice-Alternativen, Exons 9br, 23a und 48a, sind nicht aufgelistet, da sie nicht untersucht wurden. Primer Exon Primersequenz ( 5-3 ) [MgCl 2 ] T A 1 1 F: CAG ACC CTC TCC TTG CCT CTT C 1,5 mm 65 C 2 R: CCA CTT ATCCCC CCT TCC C 59 C 3 2 F: CGT CAT GAT TTT CAA TGG CAA G 1,5 mm 59 C 4 R: GCT CAC TGA ATC TAA AAC CCA GC 58 C 5 3 F: GCC ATT TCT GTT TGC CTT AGA CT 1,5 mm 58 C 6 R: TCA AAT TCA CAA AGC CTG CC 57 C 7 4a F: TTG TTC TGT GTG TGT GTT TG 1,5 mm 49 C 8 R: TTC AGT AGT CCC ATG TGG A 51 C 9 4b F: GAG ATA CCA CAC CTG TCC CCT AA 1,5 mm 58 C 10 R: TTG ACC CAG TGA TTT TTT TCA GA 57 C 11 4c F: GCT CTG AGT TGT ATT TGT GT 1,5 mm 51 C 12 R: ACA ACA GCA AAT TTT ACA TC 47 C 13 5 F: GAA GGA AGT TAG AAG TTT GTG 1,5 mm 53 C 14 R: TCT TTT AAA TGC CTA CTT GTG 58 C 15 6 F: CAT GTT TAT CTT TTA AAA ATG TTG CC 1,5 mm 61 C 16 R: GGA GGG CAA AAT TAT TTC CAT TAT 59 C 17 7 F: CTG TTA ATT TGC TAT AAT ATT AGC 1,5 mm 55 C 18 R: CAT AAT ACT TAT GCT AGA AAA TTC 55 C 19 8 F: GTA ATG TGT TGA TGT TAT TAC ATG 1,5 mm 57 C 20 R: GTC TTT TTG TTT ATA AAG GAT AAC A 57 C 21 9 F: CTT TCT ATT TGC TGT TCT TTT TGG 1,5 mm 59 C 22 R: CCT TTT TGA AAA CCA AGA GTG CA 59 C 23 10a F: GAT AAA ACT TAA AAC TAC AGT GAT AAA CAG 1,5 mm 71 C 24 R: ATG CAA TAG AAA GGA GGT GAG ATT C 65 C 25 10b F: TCC TGA GTC TTA TGT CTG ATA CCA TG 1,5 mm 57 C 26 R: TTG GCG TTT CAG CTA AAC CC 59 C 27 10c F: ATT GAA GTT TCC TTT TTT TCC TTG 1,5 mm 56 C 28 R: GTA TAG ACA TAA ACA TAC CAT TTC 56 C F: CTA TAT ATT GAA ACT ACA AAT GAA AG 1,5 mm 59 C 30 R: AGT TTT ACA ATG TAC TAA GTA CTA C 59 C 31 12a F: TGC TAT TGA CAC TTT GAT AAC TGT TTC TC 1,5 mm 59 C 32 R: TCT CAC CAT TAC CAT TCC AAA TAT TCT T 60 C 33 12b F: TTA TTC CTC TTG GTT GTC AGT GCT 2,5 mm 58 C 34 R: TTT ACC AAA TTT CAT TCA GAA AAC AAA C 59 C F: CCC AAG TTG CAA ATA TAT GTC 1,5 mm 54 C 36 R: GTG CTT TGA GGC AGA CTG AG 59 C F: TGA AGC ATT TGC TCT GCT CT 1,5 mm 53 C 38 R: GTT TCA AAC TTG ATG TAT ATT AAA 53 C F: CAA GTT TGA AAC TTG GCT GTA 1,5 mm 53 C 40 R: ATA TAT TTA GCA GAT CAG TTA AC 53 C F: GGA AGA AAT GTT GGA TAA AGC A 1,5 mm 55 C 42 R: AAA CAA GTC ACT CTA TTC ATA GA 55 C F: TAT CTG TAT GCT TAT TTG GCT CTA 1,5 mm 55 C 44 R: GTG CAG TAA AGA ATG GCC AG 55 C F: AAA CTT ACA TTT AAT TCG TTT TAC 1,5 mm 53 C 46 R: TCC TTT CTA CCA ATA ACC GC 53 C 47 19a F: TTG TTC CCT TCT GGC TTT TAT 1,5 mm 53 C 48 R: ATC TCA AAA GTT TAA ATA CAC C 53 C 49 19b F: ATT TGA GGG GAA GTG AAA GAA C 1,5 mm 56 C 50 R: GCT TTA TTT GCT TTT TGC TTT A 51 C F: CCA CCC TGG CTG ATT ATC G 1,5 mm 55 C 52 R: CTC TTA CAT GCC AGT TCT C 51 C F: TGG TCT CAT GCA CTC CAT A 1,5 mm 51 C 54 R: AAC ATC TTT CTT CTG GCT CTG 55 C F: TGC TAC TCT TTA GCT TCC TAC 1,5 mm 55 C 56 R: CAT ACC TCA GCA CAC ACA TA 53 C F: ATA TGG AGC AGG TAT AAT AAA C 1,5 mm 53 C 58 R: AAA ACA GCG GTT CTA TGT G 51 C F: CGT TGC ACT TGG CTT AAT GTC TG 1,5 mm 61 C 60 R: CCA TCA GCA GCT AGA TCC TTC TTT 59 C F: CTT ATA CTC AAT TCT CAA CTC C 1,5 mm 55 C 62 R: GAA TTT AAG ATA GCT AGA TTA TC 53 C

27 21 2 Patientengut und Methoden Primer Exon Primersequenz ( 5-3 ) [MgCl 2 ] T A F: GAC TTC ATA CAA TAA ATA ATC TG 1,5 mm 53 C 64 R: TAT TTG ATT CAA ACA GAG CAA C 53 C F: CTC CAT ATT TGT AAT CTT AGT TA 1,5 mm 53 C 66 R: GGA GAG TGT TCA CTA TCC C 53 C 67 27a F: AAT TTT TTT TCT AAG TAG TTT GCT G 1,5 mm 53 C 68 R: CAA CCA AAA AGA AAG CAA TCA ACT 55 C 69 27b F: TAG ACA ACA TAA AGC CTC ATA A 1,5 mm 53 C 70 R: CCA TCT CTC TAT ATT TGC TAT A 53 C F: TGA ATC CAG ACT TTG AAG AAT TGT T 1,5 mm 57 C 72 R: CTA GGG AGG CCA GGA TAT AGT CTA GT 58 C F: GGT TGG TTT CTG GAG CCT TTT AGA 1,5 mm 61 C 74 R: CAA CAA ACC CCA AAT CAA ACT GA 60 C F: TTG GAA CTA TAA GGA AAA ATA CGT TT 1,5 mm 55 C 76 R: AGG GTT TTC TTT GAA TTC TCT TAG A 55 C F: CCA TTT TTT CCC CGA ATT CTT 1,5 mm 58 C 78 R: CCC AAT GTG GCA CCA GAT AAA 59 C F: TTG ATT AGG CTG TTC CAA TGA A 1,5 mm 56 C 80 R: CAA AAC AAA AAA CCT CCT GAT GAT 57 C F: GTG CTA AAA CTT TGA GTC CCA TGT 2,3 mm 57 C 82 R: ATA ATC TAT ATT GAT CAG GTG AAG TA 61 C F: GCA AGG AGC ATT AAT ACA ATG TAT C 1,5 mm 55 C 84 R: CCA TGC AAG TGT TTT TAT TTA AGC 56 C F: GGT AAC AGG TCA CTT AAT GAC ATC A 1,5 mm 56 C 86 R: GAC CTC AAA TTT AAA CGT CTT TTA GA 56 C F: TCA TTC CGA GAT TCA GTT TAG GAG 1,5 mm 58 C 88 R: GAT ACC CAA AAT GAA TGC ACT CA 58 C F: TCC CCA AAA GAG AAA ACA TGG 1,5 mm 58 C 90 R: AGC AAC AAG AAA AGA TGG AAG AGT 57 C F: TGT GTG AAC CTC ATC AAC CAT C 1,5 mm 57 C 92 R: GCC TGG CCT AGT TTG CAT TT 58 C F: GGA AGA AGA CCT CAG CAG ATG C 1,5 mm 59 C 94 R: CAA CCG CCA AAA AAC CTA TAG G 59 C F: TTT TTT AAC CTG CCA CCG TTT 1,5 mm 57 C 96 F: CCT CCA TTA GTT GGA AAA TTG AAA 57 C F: AAA CGA TGG TTG TAT TTG TCA CC 1,5 mm 57 C 98 R: TGC TAC ACT GAC ATG GAA AAT TTT 57 C F: GCT CCA GGG ATG TAT TAG AGC TTT 1,5 mm 58 C 100 R: TGA CTT TCA TGT ACT CTC CCA CCT 58 C F: TGA AGT GAT TAT CCA GGT GTT TGA 1,5 mm 57 C 102 R: AAA GAC AGG CAC GAA GGT GA 57 C F: AAT TTT GGC ACA TTA TTC TGG G 1,5 mm 57 C 104 R: AGC AAG TTC ATC AAC CAT CCT T 56 C F: AGG TTT TAG TTG CTT TGA CAC TCA 1,5 mm 56 C 106 R: GCA GGC ATA CTA ATT TGA ACA GAA 56 C F: ATA TTT TTG GCT TCA GAT GGG 1,5 mm 55 C 108 R: TTG GTG TCT TAT ATT GTT GCT CAA 55 C F: AAG CGA CAC ATG ACT GCA ATG 1,5 mm 58 C 110 R: TGG CTT TCA TCA CTG GCC A 60 C

28 2 Patientengut und Methoden Denaturing High-Performance Liquid Chromatography Analyse (DHPLC) Für die Detektion von NF1-Keimbahnmutationen wurde die DHPLC Methode angewendet, auf der das WAVE Nucleic Acid Fragment Analysis System (WAVE-System) von Transgenomic basiert. Die DHPLC-Analyse nach der Methode von Oefner (Oefner et al. 1998) basiert auf der unterschiedlichen Migrationsgeschwindigkeit von DNA-Homo- und Heteroduplices bei der Passage durch die Matrix einer Trennsäule. Diese werden von einer mobilen Phase (Laufpuffer) auf die DHPLC-Trennsäule aufgetragen, die aus einer hydrophoben Polymermatrix besteht. Dabei werden die DNA-Moleküle an die Säule gebunden, indem sich hydrophobe Ammonium-Kationen des Triethylammoniumacetats (TEAA) im Laufpuffer an die negativ geladenen Phosphatgruppen der DNA anlagern und die Alkylgruppen des TEAA an die Oberfläche der Polymermatrix binden. Danach werden die DNA-Fragmente über Ionenpaar-Umkehrphasen-Chromatographie freigegeben, wobei die DNA-Fragmente mittels einer kontinuierlich steigenden Acetonitril-Konzentration von der Polymermatrix eluiert werden. Längere Fragmente haften dabei stärker und damit länger an der Säule als kürzere Fragmente. Die Trennung verläuft bei einer nicht denaturierenden Temperatur daher streng nach Fragmentlänge und ist somit unabhängig von der Basenzusammensetzung. Anders verhält es sich bei der Mutationsanalyse. Hier werden PCR-Fragmente identischer Länge voneinander getrennt, die sich aufgrund einer Mutation in ihrer Basenzusammensetzung unterscheiden. Werden die PCR-Produkte kontrolliert denaturiert, können sich bei der Renaturierung bei einer vorhandenen heterozygoten Mutation vier mögliche DNA-Duplices generieren. (Wildtyp / Wildtyp, Wildtyp / Mutante(sense), Mutante(antisense) / Wildtyp, Mutante / Mutante). Abbildung 11 veranschaulicht die vier möglichen DNA-Duplices. Diese unterscheiden sich während der DHPLC-Analyse im Bereich ihrer Schmelztemperatur aufgrund minimaler struktureller Unterschiede in ihren Migrationsgeschwindigkeiten. So entsteht ein Elutionsprofil mit bis zu vier Elutionspeaks. Mit der Größe der Migrationsunterschiede zwischen den vier möglichen DNA-Duplices wächst auch der Abstand der einzelnen Elutionspeaks. Liegen die Migrationsgeschwindigkeiten jedoch aufgrund struktureller Besonderheiten der Hetero- bzw. Homoduplices nahe beieinander, so können die einzelnen Peakflächen miteinander verschmelzen, so dass weniger als vier Peaks im Elutionsprofil auftreten (Abb. 12). Im Minimalfall zeigt eine Mutation nur einen Peak mit einer Schulter. In Einzelfällen ist sie überhaupt nicht von der Wildtypsequenz zu unterscheiden. Hebt man die Temperatur über die Schmelztemperatur der DNA-Duplices an,

29 23 2 Patientengut und Methoden denaturieren diese vollständig, so dass ihre Einzelstränge nur mit einem Elutionspeak angezeigt werden. Auch wenn nur Homoduplices vorliegen, entsteht ein Einzelpeakprofil, z.b. beim Vorliegen einer homozygoten Wildtyp-Sequenz oder beim Vorliegen einer homozygoten Mutation. Durch Zumischen von Wildtyp-Amplifikat kann die homozygote Mutation detektiert werden. Für die DHPLC-Analyse werden die PCR-Produkte bei 95 C 20 min. denaturiert und zur Bildung der DNA-Duplices schrittweise (1 C/min) auf 65 C abgekühlt. Die spezifischen Schmelztemperaturen wurden mittels der Navigator -Software ermittelt. Zur Ermittlung der optimalen Analysetemperatur wurden die Amplifikate um das von der Navigator -Software berechnete Temperaturoptimum mit mindestens 3 verschiedenen Temperaturen analysiert, meist 2C unter und über der vorgeschlagenen Temperatur. Die optimalen Temperaturbedingungen und die Konzentration des Puffers B sind in Tabelle 5 aufgelistet. Es wurden 5 µl PCR-Produkt auf die DNA Sep Column Trennsäule injiziert und mit einem linearen Acetonitril-Gradienten aus Puffer A (0,1 M TEAA, ph 7,0) und Puffer B (0,1 M TEAA, 25% Acetonitril, 0,1 mm EDTA) eluiert. Die Abb. 11: Schematische Darstellung Durchflussrate des Elutionspuffers durch die des Funktionsprinzips einer DHPLC- Analyse. Säule lag konstant bei 1,5 ml/min. Die Gesamtanalysezeit betrug 2,5 min. mv m Abb. 12: Beispiel eines DHPLC Diagramms. Nach Denaturierung der PCR-Produkte können sich bei Mutationen während der Renaturierung bis zu vier verschiedene DNA-Duplices bilden. Diese unterscheiden sich aufgrund kleinster struktureller Unterschiede in ihrer Schmelztemperatur und führen zu minimalen Migrationsunterschieden durch die Polymermatrix. Die gestrichelte Kurve gilt als Referenz und kennzeichnet das Wildtyp-DNA- Duplex. Jeder weitere Peak oder jede weitere Schulter zeigt das Vorhandensein eines Nicht- Wildtyp-Duplices an. Diese müssen zur Verifizierung der Mutation oder des Polymorphismus sequenziert werden. Die X-Achse kennzeichnet die Dauer in Minuten, die Y-Achse gibt die elektrische Spannung in Millivolt an.

30 2 Patientengut und Methoden 24 Tab. 5: Temperaturen der Trennsäule und Konzentration des Puffers B bei der DHPLC-Analyse. Produkt Größe (bp) Temp. Start Puffer B(%) Produkt Größe (bp) Temp. Start Puffer B(%) Exon C 57,4 Exon ,6 55,1 Exon C 59,7 Exon C 57,5 Exon C 57,4 Exon C 54 Exon 4a C 57,1 Exon C 52,5 Exon 4b C 53,5 Exon C 56,7 Exon 4c C 52,2 Exon 27a C 53,9 Exon C 53,3 Exon 27b C 53,9 Exon C 56,8 Exon C 62 Exon C 57,5 Exon C 60,1 Exon C 56 Exon C 57,3 Exon C 55,6 Exon C 58 Exon 10a C 55,7 Exon C 56,7 Exon 10b C 55 Exon C 58,8 Exon 10c C 53,3 Exon C 60,7 Exon C 57 Exon C 60,7 Exon 12a C 57,8 Exon C 53,7 Exon 12b C 56,2 Exon C 57,6 Exon C 57,7 Exon C 56,8 Exon C 58 Exon C 56,8 Exon C 53,5 Exon C 54,3 Exon C 64,4 Exon C 57,7 Exon C 58,8 Exon C 57,4 Exon C 57,3 Exon C 60,6 Exon 19a C 58,4 Exon C 56,4 Exon 19b C 54,5 Exon C 55,5 Exon C 58,9 Exon C 57,8 Exon C 60,3 Exon C 61,4 Exon C 56,1