Umgang mit Zellen und Zellkulturen

Transkript

1 Jenal & Partners Biosafety Consulting Umgang mit Zellen und Zellkulturen Eigenschaften von Zellkulturen Einstufung in Gruppen und Klassen Arbeitspraktiken HELA Zellen Ursula Jenal Jenal & Partners Biosafety Consulting ursula.jenal@jenalpartners.ch

2 Definitionen Primäre Zellen direkt aus Gewebe entnommen Etablierte Zelllinie über mehrere Passagen gezüchtet und untersucht Jenal & Partners Biosafety Consulting

3 Jenal & Partners Biosafety Consulting Definitionen Kontinuierliche Zelllinie: immortalisierte Zellen vermehren sich kontinuierlich Seneszenz Virusinfektion Chemikalien aus Tumor proliferativer Stimulus Proliferation Apopotose

4 Eigenschaften von tierischen und menschlichen primären Zellen und etablierten Zelllinien getrennt von der Ursprungsumgebung gehalten unter künstlichen Bedingungen empfindlich auf Störungen ideale Nahrungsgrundlage für Mikroorganismen Jenal & Partners Biosafety Consulting

5 Jenal & Partners Biosafety Consulting Eigenschaft von Zellkulturen: Beherbergung pathogener Mikroorganismen Zellen von Vögeln und Invertebraten Säugerzellen Affenzellen Menschenzellen gut charakterisierte und stabile Zelllinien kontinuierliche Zelllinien primäre Zellen Risiko Risiko

6 Jenal & Partners Biosafety Consulting Eigenschaft von Zellkulturen: Beherbergung pathogener Mikroorganismen Peripheres Blut lymphoide Zellen neuronale Zellen Risiko Endothelzellen Darmepithelzellen Epithelzellen Fibroblasten

7 Jenal & Partners Biosafety Consulting Herkunft der pathogener Mikroorganismen Herkunft: aus getestetem oder ungetestetem Gewebe - grosse Differenzen - 15% falsch identifiziert oder falsch beschrieben - Kontamination mit unbekannten Viren (Squirrel Monkey Retrovirus 1-3%) Kontamination während der Arbeit: - Kreuzkontamination mit anderen Zellen - von Laborpersonal - aus kontaminierten Medien - Kontamination mit Mycoplasma: - primäre Zellen 1-5%, - kontinuierliche Zelllinien 35% Kulturbedingungen (Nährstoffe, Wachstumsfaktoren) und Zellalterung Erythrozyten mit Mycoplasma Abdrücken

8 Jenal & Partners Biosafety Consulting Eigenschaft von Zellkulturen: Risiko-reiche Inserts Sequenzen für Proteine mit transformierenden Eigenschaften (aktiviert oder nicht aktiviert) Cytokine, Hormone, Fachstumsfaktoren, Antigene - 1 Fall von Tumorformation nach Nadelstich mit Onkogen-exprimierender Zelllinie) Endogene retrovirale Sequenzes, ERV ERV Promoteraktivität in Zelllinien

9 Jenal & Partners Biosafety Consulting Grundlage zur Einstufung von Zellkulturen WHO biosafety guidelines Verwende Praktiken der Sicherheitsstufe 2 wenn über die Zellen nur limitierte Information vorhanden ist. Empfehlung der EFBS zum sicheren Umgang mit menschlichen und tierischen Zellen und Zellkulturen

10 Jenal & Partners Biosafety Consulting Risikobewertung von Zellkulturen 1. Risikogruppe Quelle, Zertifikate, Eigenschaften, Wissensstand + 2. Art der Tätigkeit, Gentechnische Veränderung, Kombination mit Vektoren, Umfang, Kulturbedingungen + 3. Qualitätssicherung Qualitätskontrolle Gute Laborpraxis? G 1 G 2 G 3 G 4 Risiko = vernachlässigbar klein mittel hoch

11 Jenal & Partners Biosafety Consulting Grundlage zur Einstufung von Zellkulturen Information Klasse 1 BSL1 Risiko Qualitätskontrolle Sichere Anwendungspraxis Klasse 2 BSL2 No way!!! Reinraum BSL1/BSL2

12 Einstufung von Zellen gemäss Art der Zellen Gruppe Primäre Zellen und Zelllinien, mit Verdacht auf eine Infektion mit einem spezifischen pathogenen Mikroorganismus. Primäre Zellen und Zelllinien, bei denen eine Infektion nicht ausgeschlossen werden kann. Primäre Zellen und Zelllinien, Infektion mit einem pathogenen Mikroorganismus mit grösster Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen. gemäss pathogen Identifizierte und gut charakterisierte Zelllinien. 1 Identifizierte und gut charakterisierte Zelllinien oder primäre Zellen, mit einem spezifischen pathogenen Mikroorganismus infiziert. Humane Zellen mit Gensequenzen, die einen schädlichen Effekt haben könnten, wenn sie exprimiert werden (auch unter nicht gewöhnlichen Kulturbedingungen). Zellen, die potentiell schädliche Gensequenzen enthalten, diese aber nicht exprimieren können. Jenal & Partners Biosafety Consulting gemäss Pathogen 2 1, wenn pathogenfrei

13 Einstufung von Tätigkeiten mit Zellen und Zellkulturen Kulturen von charakterisierten Zellen der Gruppen 1 3 Produktion von Viren oder viralen Vektoren auf Zellkulturen Kultur von Zellen mit unzureichender Charakterisierung oder mit Verdacht auf Infektion mit pathogenen Mikroorganismen Kultivierung von Zellen mit gentechnischen Veränderungen Klasse Klasse gemäss Gruppe der Zellen, bzw. des pathogenen Mikroorganismus Klasse gemäss Gruppe des Vektors oder Virus - Klasse 2 - Klasse 3 (bei Verdacht auf Mikroorganismen der Gruppe 3) Klasse gemäss Bewertung des Risikos der Zellen, Vektoren und Inserts Analyse von Zellen ohne Kultivierung Anforderungen der SAMV zum Schutz vor Exposition gegenüber potentiell infektiösem Material befolgen Jenal & Partners Biosafety Consulting

14 Jenal & Partners Biosafety Consulting Arbeitspraxis zur Verhinderung von Kontaminationen mit Mikroorganismen Einhalten bzw. Überprüfen bester Laborpraxis (zertifizierter Materialien, persönlicher Hygiene, Dekontamination, biologische Sicherheitswerkbank Klasse II); Master- und Arbeitszellbanken mit tiefen seriellen Überimpfungszahlen; so wenig wie möglich Antibiotika verwenden; routinemässiges Testen der verwendeten Zelllinien zur Authentifikation; routinemässiges Testen der verwendeten Zelllinien zum Nachweis von Kontaminationen, bzw. zur Bestätigung des Fehlens von Kontaminationen; für gewisse Institutionen GMP-Methoden (good manufacturing practice). Biosicherheit! Qualitätssicherheit Personal, Mensch, Umwelt Produkte-, bzw. Forschungsqualität

15 Jenal & Partners Biosafety Consulting Test zum Nachweis von kontaminierenden Mikroorganismen Beim Einkauf/Bezug von Zellen ein Zertifikat bzw. Nachweis für Überprüfung auf Mikroorgnismen verlangen Zelllkulturen regelmässig unter dem Mikroskop auf ihre Morphologie überprüfen Wachstumskurve beobachten Prallelkultur (aus Masterzellbank) ohne Antibiotika mitlaufen lassen; Kulturen regelmässig auf Mykoplasmen überprüfen (z.b. Fluoreszenzfarbstoff); Isoenzym-Authentifizierungskit DNA-Fingerprinting so wenig wie möglich Antibiotika verwenden;

16 Test zum Nachweis von kontaminierenden Mikroorganismen DSMZ Testangebote DSMZ Service Mycoplasma testing and elimination Broth-agar microbiological culture method Polymerase chain reaction 150,00 150,00 Authentication of human cell lines Multiplex PCR single locus analysis (per sample) 150 Detection of viruses: Detection or verification of species Cell culturing for mycoplasma testing (if applicable) 150,00 Mycoplasma elimination and verification 1.500,00 Polymerase chain reaction (per virus out of 8 viruses: EBV, HBV, HCV, HIV-1, HIV-2, HTLV-I/-II, 150 SMRV, XMRV) Cell culturing for virus testing 150 PCR detection of human and animal species of the panel of DSMZ cell bank One to three samples (per PCR-assay) 150 Four to six samples (per PCR-assay) 200 PCR detection of monkey cell lines Inquire Jenal & Partners Biosafety Consulting

17 Jenal & Partners Biosafety Consulting FRAGEN?