EliSpot in der Borreliose-Diagnostik

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1 EliSpot in der Borreliose-Diagnostik Update Lyme Disease for Practitioners BCA-clinic Augsburg

2 Infektion - Infektionserkrankung Invasion und Vermehrung von Mikroorganismen im menschlichen Organismus Durch Mikroorganismen hervorgerufene Störung der Lebensvorgänge Diagnostik bei Infektionserkrankungen: Beschreibung des Krankheitsbildes und seinen Verlauf Identifizierung des Erregers Nachweis der Immunologischen Reaktion Serologischer Nachweis durch Antikörper Nachweis der zellulären Immunreaktion

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4 Funktionen der T-Lymphozyten T - Helferzellen (CD4+) sind die Schaltzellen des Immunsystems Erkennen Antigene die von antigenpräsentierenden Zellen dargeboten werden reagieren mit Poliferation und Freisetzung von Zytokinen Th1 verstärkt die zellulären Immunantwort, Th2 stimuliert die Antikörperproduktion Zytotoxische T - Zellen (CD8+) setzen u.a. Substanzen frei die veränderte / infizierte Zellen absterben lassen Regulatorische T Zellen (CD4 und CD25 bzw. FoxP3) regulieren die Immunantwort

5 Zytokine der T-Zell Subpopulationen CD8+-T-Zellen CD4+-T-Zellen Th 1- Zellen produzieren: IFN-g, IL-2, IL-3, Lymphotoxin und TNF-a Th 2- Zellen produzieren: IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 und IL-10 Th 17 - Zellen produzieren: IL -17, IL-21, IL-22 und IL-26 Regulatorische T-zellen (T reg) produzieren: IL-10 und TGF-b

6 Zell-vermittelte Immunreaktion Signifikante T-zelluläre Reaktivität auf Borrelien Proteine ist bekannt und belegt, sie korreliert mit der klinischen Manifestation. Durchflusszytometrie Messung der Lichtstreuung wenn Zellen den rechtwinklig zum Probenfluss angeordneten Laserstrahl passieren. Immunologische, DNA- und Zellfunktions- Datenanalyse LTT Messung der Proliferation von T-Zellen nach Stimulation mit Antigen über 5 Tage. EliSpot Der EliSpot misst direkt die Anzahl der aktivierten T- Zellen aufgrund ihrer Zytokinausschüttung.

7 Blutentnahme Röhrchen sollten immer ganz gefüllt sein Blut sollte nicht älter als 48 h sein Blutproben bei RT lagern Nicht stark schütteln / zentrifugieren

8 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Mikrotiterplatte mit Membranboden, beschichtet mit Antikörper gegen nachzuweisendes Zytokin (z. B. IFN) Isolation der Lymphozyten (FICOLL) Zellsuspension wird mit Antigen / Mitogen h bei 37 C inkubiert Zuvor aktivierte T-Zellen setzen Zytokine frei, die durch die Antikörper an die Membran gebunden werden. Negativkontrolle Probe

9 Nach erfolgter Inkubation werden die Zellen von der Platte entfernt. Darauf folgt die Zugabe von enzymmarkierten Antikörpern und eine weitere Inkubation. Zugabe des Substrates zur Visualisierung der Spots. Y Spots IFN-γ

10 Standardisierung über externe Qualitätskontrolle 1. Qualitätszirkel EliSpot Probenversandt halbjährlich 2. QC Kit PBMC Pool - Versand auf Anfrage

11 Leerwert Positivkontrolle Antigen 1 Antigen 2 Reaktiv Nicht Reaktiv Nicht auswertbar Nicht auswertbar

12 Zur Interpretation der Ergebnisse wird ein Stimulationsindex: Spot Anzahl Antigen mix Spot Anzahl Medium-Kontrolle = Stimulation index (SI) Beispiel Lymespot (IFN): Probe ist reaktiv SI >3 Probe ist negativ SI < 2 Probe ist grenzwertig SI zwischen 2 und 3

13 Interpretation der EliSpot Ergebnisse Reaktive T-Zellen (IFN- positiv) weisen auf einen Kontakt mit Borrelien hin. Immer im Zusammenhang mit klinischem Bild zu beurteilen. Verlaufskontrolle Problematik: Wann ist eine Borreliose behandlungsbedürftig? Stehen die Symptome im Zusammenhang mit der Infektion? Kann die Weiterentwicklung des EliSpots zur Klärung beitragen?

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15 Giuseppe Pantaleo and Alexandre Harari NATURE REVIEWS IMMUNOLOGY, vol , 2006

16 Polyfunktionale / Multifunktionale T-Zellen Levels of disease activity and viral replication correlate with distinct functional signatures of T-cell responses (e.g. IFN/IL-2) Beispiel: HIV HCV CMV, EBV und andere Giuseppe Pantaleo and Alexandre Harari NATURE REVIEWS IMMUNOLOGY, vol , 2006 Effector T-cells : IFNγ Memory T-cells: IFNγ and IL-2 Distinguish between active and latent disease?

17 Von EliSpot zu FluoroSpot EliSpot FluoroSpot 1983: Enzym basierter Assay zum Nachweis eines Zytokins z. B. IFN- 2009: Fluoreszenz basierter Assay zum Nachweis von zwei Zytokinen z. B. IFN- /IL : Fluoreszenz basierter Assay zum Nachweis von drei Zytokinen z. B. IFN- /IL-2/IL-17

18 Anwendung in der TB Diagnostik: S. Bittel Examination of dominant IL-2 functional T-cell substes by fluorescence-based EliSpot assay

19 ispot LymeSpot revised

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22 Nahezu gleiche Anzahl an IFN und IL-2 produzierenden Zellen, spricht für eine latente Infektion Kein Nachweis von IFN produzierenden Effektorzellen, bei gleichzeitigem Nachweis von IL-2 produzierenden Memoryzellen, spricht für eine abgelaufene Infektionserkrankung

23 Gerne beantworte ich Ihre Fragen und bedanke mich für Ihre Aufmerksamkeit!