Erfurter Borreliose-Tage März 2015

Transkript

1 Die diagnostische Wertigkeit des Lymphozyten- Transformationstests (LTT) bei Lyme-Borreliose Dr. Volker von Baehr Erfurter Borreliose-Tage März 2015 Ich erkläre folgenden Interessenkonflikt: Ich bin angestellter Laborarzt des Institut für Medizinische Diagnostik Berlin (IMD). Das IMD Labor führt die Borrelienserologie und den Lymphozytentransformationstest durch und rechnet diese ärztliche Leistung nach GOÄ und EBM ab.

2 Was war mein Auftrag für heute? - Diagnostische Bedeutung des LTT - kurze Darstellung der Methodik - Methodische Schwierigkeiten bei der Durchführung des LTT - Methodische Verbesserung des LTT seit den 1980er Jahren - Notwendiger Qualitätsstandard beim LTT - Pro und Kontra LTT in der wissenschaftlichen Literatur - Erklärung der Abwertung des LTT in einigen Stellungnahmen - notwenige Studien zur besseren Verifizierung der diagnostischen Wertigkeit des LTT

3 Die Labordiagnostik der Borreliose befindet sich in einem Dilemma. Der direkte Erregernachweis (PCR, Kultur) ist in der Praxis kaum hilfreich Es steht nur der indirekte Erregernachweis zur Verfügung (Serologie) ABER: Seropositivität bedeutet nicht zwingend Behandlungsbedürftigkeit Serologie ist ungeeignet zur Verlaufskontrolle Der Nachweis von Antikörpern ist in keinem Stadium lückenlos möglich Wilske B. Diagnosis of lyme borreliosis in europe. Vector Borne Zoonotic Dis. 2003;3: Die Methoden des Antikörpernachweises sind in Deutschland nicht standardisiert (unterschiedliche Ergebnisse von Labor zu Labor) Borrelien ELISA erfüllt nicht Kriterien eines hochsensitiven Suchtestes

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5 Auch im Immunoblot sind falsch positive Befunde möglich! 1. Echte falsch positive Befunde - beim IgM bedingt durch multireaktive IgM-Antikörper und IgM Immunkomplexe - auch beim IgG (z.b. durch Rheumafaktoren möglich) - durch Kreuzreaktivität (Lues, EBV, andere Infektionen?) 2. Richtig positive Befunde als Seronarbe, die in der klinischen Beurteilung oft als falsch positiv betitelt werden.

6 Deshalb wird eine Labormethode benötigt, welche die aktive Auseinandersetzung des Immunsystems mit dem Erreger anzeigt. Zirkulieren Borrelien-spezifische memory-effektor-t-zellen in signifikanter Anzahl zum Untersuchungszeitunkt im Patientenblut? Wenn nicht, spricht das gegen eine aktive Auseinandersetzung des zellulären Immunsystems mit Borrelien.

7 Was ist der Lymphozytentransformationstest? Testprinzip des LTT: Nachweis einer in vitro-induzierten antigen-spezifischen Aktivierung von aus dem Patientenblut isolierten T-Lymphozyten an Hand der Zellproliferation Erstbeschreibung 1960, seitdem kontinuierliche Entwicklung zu einem hoch sensitiven und reproduzierbaren immunologischen Testverfahren

8 Indikationen des Lymphozytentransformationstest? Immunfunktionsdiagnostik Als Stimulanz dienen Recall-Antigene auf die im Normalfall eine deutliche T-zelluläre Immunität vorliegt (u.a. Tetatoxoid, Influenza- Antigen, CMV-Antigen) Allergiediagnostik Es wird nachgewiesen, ob ein Patient auf zu untersuchende Allergene eine Gedächtnisreaktion zeigt, d.h. immunologisch sensibilisiert ist. Infektionsdiagnostik Anwendung bei obligat oder fakultativ intrazellulär persistierenden Erregern als Ergänzung zur serologischen Diagnostik (z.b. Borrelien, Chlamydien, Herpesviren).

9 Das Problem des LTT auf Borrelienantigene ist es, die T-Effektor-Memory-Zellen antigenspezifisch nachzuweisen. Die Antigene und die gewählte Antigendosis müssen geeignet sein, zwischen Memory-T-Zellen und Effektor Memory-T-Zellen zu unterscheiden. d.h. 1. Nicht-Infizierte müssen im LTT negativ sein 2. Serokonvertierte Gesunde müssen negativ sein bzw. sich in der Stärke der Reaktion deutlich von Patienten mit klinischer Borreliose unterscheiden

10 Durchführung des Lymphozytentransformationstest? 1. Lymphozyten und Monozyten (PBMC s) werden durch Dichtegradientenzentrifugation aus heparinisiertem Blut des Patienten gewonnen Serum Lymphozyten und Monozyten Erythro- und Granulozyten (werden verworfen)

11 2. Nach mehreren Waschvorgängen werden die Patientenzellen in ein Zellkulturmedium (u.a. mit Zusatz von IFN-α) aufgenommen und anschließend in Kultur gebracht und mit den entsprechenden Antigenen unter Zusatz von autologem Serum für 5 Tage stimuliert (Dreifachansätze). Zugabe der Testantigene Pipettieren der Zellen in sterile Zellkulturplatte Lagerung im Zellinkubator für 5 Tage (37 C, 5% C0 2 )

12 3. Während der 5-tägigen Zellkultur proliferieren die antigenspezifisch-aktivierten T-Lymphozyten LTT- Ergebnis nach 5 Tagen: Tag 0 Klonal proliferierte antigenspezifische T-Lymphozyten

13 4. Am 5. Tag werden alle Zellansätze mit Tritium-markiertem Thymidin gepulst, welches sich in den darauffolgenden 12 Stunden in die DNA von sich mitotisch teilenden Lymphozyten einbaut. Τ Τ Τ Τ Τ Τ Am 5. Tag Zugabe von 3-H-Thymidin zu den kultivierten Zellen

14 5. Am 6. Tag werden die Zellen in einen DNA-Adsorptionsfilter geerntet und in jedem Ansatz werden die counts per minute (cpm) als Mass des Zell-gebundenen 3H-Thymidin bestimmt. Der Gehalt an Zell-gebundenem 3H-Thymidin ist das Mass für die stattgefundenen Zellteilung im Stimulationsansatz. Ernte der kultivierten Zellen Messung der Zellteilungsrate als cpm im Beta-Counter

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17 Die Spezifität lässt sich zytofluorometrisch bestätigen Side Scatter Plot s Ch. 22/14 CD25 CD3 Spezifische T-Zellaktivierung hier 0,34% der T-Zellen CD3 Ch. 122/11 CD25 Unspezifische T-Zellaktivierung hier 24,6% der T-Zellen CD3

18 Probleme des LTT 1. Unspezifität der Antigene muss ausgeschlossen sein (Vortestung jeder Charge an Nicht-Infizierten Gesunden) 2. Die richtige Dosis muss in Voruntersuchungen ermittelt werden (Vortestung an infizierten Gesunden, Kontrolle über zytofluorometrische Testverfahren, Wiederholung bei jeder neuen Charge) 3. Die Präanalytik muss einwandfrei sein (Antikoagulanz, Transport, Lagerung, Positiv-/Negativkontrollen) 4. Die Durchführung des LTT muss durch geschultes Personal erfolgen (kaum automatisierte Schritte möglich) 5. Die Zellkulturbedingungen müssen geeignet sein um am 5. (6.) Tag die optimale Trennschärfe zwischen unspezifischer Aktivierung und antigenspezifischer Stimulation zu haben (autologes Serum, IFN-α, Polymyxin B, Kontaminationskontrollen, Laborausstattung, Steriler Arbeitsbereich)

19 Der LTT ist zu 90% Handarbeit und daher nur bedingt standardisierbar.

20 Herausforderung Präanalytik!!! Temperierte over night-logistik ist essentiell für die zelluläre Immundiagnostik Abholung Station 7.30 Anlieferung Berlin Außentemperatur 4.12 / C bis -11 C

21 Problem: Geeignete Positivkontrolle Zum Ausschluss falsch negativer Befunde muss eine Antigen-spezifische Positivkontrolle gewählt werden Schädigung antigenpräsentierender Zellen bleiben unerkannt, wenn nur Mitogene (z.b. PWM) als Positivkontrolle verwendet werden.

22 Problem: Trennschärfe des LTT: positiv/negativ

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24 Fazit Falsch positive Ergebnisse sind möglich durch: - Verwendung unspezifisch aktivierender Antigene - zu hohe Antigendosen im Test - ungeeignete Durchführung des LTT (unsteriles, unsauberes Arbeiten) - ungeeignete Laborbedingungen (Zellkulturbereich) - ungeeignete Zellkulturplatten - geringes Stimulationsniveau im LTT Ergebnis = Antigen-Stimulationswert / Basalwert; bei niedrigen Werten Gefahr falsch positiver (unspezifischer) Reaktionen - durch erhöhte unspezifische T-Zellreaktivität bei vorbestehenden Entzündungserkrankungen (multireaktive T-Zellen, CD5 + B-Zellen) (zu minimieren durch IFN-α-Zusatz und geeignete Zellkulturbedingungen) - verbliebene Antigenstrukturen mit kreuzreaktiven Eigenschaften die in Einzelfällen positive Reaktionen bedingen können

25 Problem des zu geringen Stimulationsniveaus = Starker Einfluss einzelner Ausreißer auf das Resultat Der absolute Fehler von ca cpm hat nur bei niedrigem Stimulationsniveau einen falsch grenzwertig positiven Befund zur Folge Lösung: Nur Auswertung von Analysen mit einem Stimulationsniveau von > 800 cpm

26 Methodische Verbesserung seit den 1980er Jahren Qualität der Borrelien-Lysatantigene (Kultur, Reinigung, Kontrolle) Qualität der Zellkulturmedien, -platten, - brutschränke etc. Zusatz von Interferon-alpha und Polymyxin B zur Zellkultur Verwendung von autologem (Patienten-eigenem) Serum in der Zellkultur Übergang von Flüssigszintillationszählern zu Festphase-β-Countern ausreichend hoher Probendurchsatz im Labor (ca. 50 Proben pro Tag), nur dann ist speziell geschultes Personal möglich. Möglichkeit der methodenunabhängigen Kontrolle im Rahmen der Validation (Zytofluorometrie, (Zytokine?)

27 Jedes Labor muss seine Methodik etablieren und validieren

28 Wann macht ein Einsatz des LTT für die Diagnostik überhaupt Sinn? 1. Gesunde müssen Normalwerte haben 2. Seronegative LTT-positive müssen die Ausnahme sein 3. Patienten mit klinischem Verdacht müssen (oft) positiv sein Qualitätskennziffern des LTT im IMD Berlin Spezifität: 91,6 98,7% (abhängig vom Untersuchungskollektiv) Sensitivität: 89,4 % (?, nicht Gruppen-unterschieden)

29 Ein (korrekt) positiver LTT muss durch eine antibiotische Therapie rückläufig sein (negativ werden).

30 Mit welchen Argumenten wird der LTT in Fachkreisen abgelehnt? unnötig, weil die Serologie ausreichend ist. zu viele falsch positive Ergebnisse Differierende Ergebnisse zwischen verschiedenen Labors Falsche Interpretation der Ergebnisse hinsichtlich Sensitivität und Spezifität im Vergleich zur Serologie Fehlende aktuelle unabhängige Studien kostenintensiv und die Durchführung derzeit nur in kommerziell orientierten Labors möglich. Negative Beurteilung in der AWMF S1-Leitlinie Neuroborreliose viel negative Erwähnung in medizinischen Sekundärliteratur

31 Der LTT wird in der AWMF S1 Leitlinie Neuroborreliose nicht empfohlen (Stand )

32 Verwendete Quellen für die Aussage sind: Wilske B, Fingerle V, Schulte-Spechtel U. Microbiological and serological diagnosis of Lyme borreliosis. FEMS Immunol Med Microbiol 2007b; 49: 13 21

33 Die zweite verwendete Quelle ist: Wilske B, Fingerle V. Lyme-Borreliose Diagnostik. Mikrobiologe 2005; 15:

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38 Krause et al Arthritis Rheum 1991; 34:

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40 Der LTT mit lysierten BbA wurde bei 42 Patienten mit LB und 77 nachweislich nichtborrelieninfizierten Patienten mit anderen Erkrankungen durchgeführt. 19 der 42 LB- Patienten zeigten einen positiven LTT und nur 4 der 77 Kontrollen. Die Autoren berechnen daraus eine Sensitivität von 45% und eine Spezifität von 95%. Conclusion::. The T-cell proliferative assay may be a helpful diagnostic test in the small subset of patients with late Lyme disease who have negative or indeterminant antibody responses by ELISA. Dressler et al: Ann Intern Med 1991; 115:533-9

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42 55 Kinder mit gesicherter LA und 48 Kontrollpersonen Spezifität des LTT 78% bei einer Sensitivität von 77%. Diskrepant zu allen anderen Studien war, dass der LTT bei 8 Kindern mit LA nach antibiotischer Therapie positiv wurde und bis zu 19 Monate lang positiv blieb. Huppertz 1996; Eur J Pediatr 1996; 155:

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44 A significant difference was observed when the B. burgdorferi sonicate was used. In this case, only the borreliosis patients reacted with an elevated PBMC proliferation and GM-CSF secretion. Schempp et al, Zentralbl Bakteriol 1993; 279:417-25

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46 LTT durchgeführt bei 99 LB-Patienten und 21 gesunden Probanden Der LTT signifikant erhöht bei LB-Patienten EM (SI 9,8) ACA (SI 11,8) Lymphozytom (SI 7,2) Bei umschriebener Sklerodermie waren die LTT-Ergebnisse höher als bei den Kontrollen (SI 6,6 vs. 3,3), erreichten aber kein Signifikanzniveau. Buechner SA. Arch Dermatol 1995; 131:673-7

47 Conclusion:. Our findings show that a significant lymphoproliferative response to B. burgdorferi occurs in the majority of patients with cutaneous manifestations of Lyme borreliosis. The lymphocyte proliferation assay may be of diagnostic value in patients in whom Lyme borreliosis is strongly clinically suspected and who have nondiagnostic levels of antibodies against B burgdorferi Buechner SA. Arch Dermatol 1995; 131:673-7

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49 39 Patienten mit akutem EM untersucht (4 Tage nach Auftreten) und unmittelbar nach der antibiotischen Therapie. Die 20 Kontrollpatienten dienten nur der cut off-festlegung des LTT

50 Fazit: Kontrolle des LTT s frühestens 6 Wochen nach Therapieende Vaz A et al Infect Immun. 2001;69:

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52 In der Arbeit von Ekerfelt (1999) wurde der LTT gar nicht verwendet, sondern der ELISPOT

53 Es ist bekannt, dass der ELISPOT nicht zwischen aktiver LB und asymptomatischen seropositiven Fällen differenziert. Ekerfelt C. et al. Clin. Exp. Immunol 1999; 115:

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56 Zusammenfassung Das durchführende Labor muss die geeignete Analytik aber auch die Präanalytik sicherstellen. Blutproben für zelluläre Tests gehören nicht in die Post sondern in die Hände qualifizierter over-night-kurierdienste. Das Labor muss die Spezifität seiner LTT-Methode sicherstellen Trotzdem ist eine 100%ige Spezifität und Sensitivität nicht zu erreichen. Positive Ergebnisse müssen unter Berücksichtigung des klinischen Bildes interpretiert werden. Weitere klinische Studien sind notwendig und sollten von Befürwortern und Kritikern gemeinsam angegangen werden. (Selektion Patientenkollektive, Kosten, Aufwand, Logistik) Der LTT hat eine andere Aussage als der Elispot-Test.