p53-menge bei 4197 nach Bestrahlung mit 4Gy Röntgenstrahlung 3,51 PAb421 PAb1801 PAb240 Do-1 Antikörper

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1 1.1 STRAHLENINDUZIERTE P53-MENGE FRAGESTELLUNG Die Kenntnis, daß ionisierende Strahlen DNA Schäden verursachen und daß das Protein p53 an den zellulären Mechanismen beteiligt ist, die der Manifestation der Zellschädigung folgen, bedingt eine Untersuchung der strahleninduzierten p53-menge. Hierzu wurden die Plattenepithelkarzinom-Zellinie 4197 (p53-wildtyp) und 4 verschiedene p53-antikörper, die auch schon zum Nachweis des konstitutiven p53-proteins bei dieser Zellinie verwendet wurden, benutzt. Ebenso sollten wieder die unter 3.1 zum p53-nachweis angewendeten Methoden zum Zweck der Vergleichbarkeit eingesetzt werden ERGEBNISSE Durchflußzytometrie Das nachfolgende Diagramm stellt p53-fluoreszenzindizes dar, die Ansätzen mit exponentiell wachsender Zellen nach einer 24stündigen Kultur, einer sich daran anschließenden Röntgenbestrahlung mit 4Gy Röntgenstrahlen und einer zusätzlichen zweistündigen Inkubation, erhalten wurden. Es wurden p53-fluoreszenzindizes für verschiedene p53-antikörper bestimmt. 16 p53-menge bei 4197 nach Bestrahlung mit 4Gy Röntgenstrahlung 10,51 Fluoreszenzindex [Fi] ,92 0,54 0,18 0Gy 4Gy 4Gy + 2h 2,55 2,93 2,22 3,51 6,60 0,00 0,10 0,19 PAb421 PAb1801 PAb240 Do-1 Antikörper Abbildung 1: p53-fluoreszenzindizes nach Bestrahlung bei der Zellinie Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von den Mittelwerten. Es zeigt sich, daß alle Inkubationen (0Gy, 4Gy und 4Gy+2h) bei den Antikörpern PAb1801 und PAb240 zu einem positiven p53-nachweis führen (Fi>0,5). Dagegen erweisen sich lediglich der 4Gy-

2 und der 4Gy+2h-Ansatz bei der Inkubation mit dem Antikörper PAb421 als positiver p53-nachweis. Die Inkubationen mit dem Antikörper Do-1 zeigen keinen p53-nachweis. Eine statistischer Vergleich wurde mit Hilfe des Student t-tests durchgeführt. Die ermittelten p-werte sind in folgenden Tabellen dargestellt. P-Werte kleiner als 0,05 (5% Signifikanzniveau) sind grau unterlegt. Inkubation 4Gy Antikörper PAb421 PAb1801 PAb240 Do-1 PAb421 0,0461 0Gy PAb1801 0,3459 PAb240 0,1275 Do-1 0,0685 Inkubation 4Gy+2h Antikörper PAb421 PAb1801 PAb240 Do-1 PAb421 0,0025 0Gy PAb1801 0,0842 PAb240 0,0669 Do-1 0,1567 Tabelle 1: P-Werte für p53-fluoreszenzindizes von p53-antikörpern bei der Plattenepithelkarzinom- Zellinie Western blotting Die Zellen der Zellinie 4197 (p53-wildtyp) wurden mit 4Gy Röntgenstrahlen bestrahlt und anschließend 2 Stunden inkubiert. Die Inkubation erfolgte jeweils mit einem unspezifischen Kontroll- Antikörper und einem spezifischen p53-antikörper (Do-1). Kontrolle 4Gy 4Gy+2h Kontrolle 4Gy 4Gy+2h Negativ-Antikörper p53-antikörper - Do-1 20µl 40µl 20µl 40µl 20µl 40µl 20µl 40µl 20µl 40µl 20µl 40µl

3 ,5 14,3 Abbildung 19: Western blots der Zellinie 4197 inkubiert mit einem Kontroll-Antikörper und dem p53-antikörper Do-1 (24h Kultur + Bestrahlung + 2h Kultur). Es wurden pro Zellinie und Antikörper jeweils 20 und 40 µl aus einem 500 µl Zelllysatansatz aufgetragen. Die Berechnung der Fluoreszenzindizes des blots erfolgte nach einer densitometrischen Bestimmung der einzelnen Banden und ist in folgendem Digramm dargestellt. p53 Fluoreszenzindizes - "Western Blot" - Do-1 0,5 0,37 0,4 Fluoreszenzindex 0,3 0,2 0,1 0,0 0 0,02 0,05 0 0,19 20µl 40µl Volumen Zellysat 0Gy 4Gy Behandlung 4Gy+2h

4 Abbildung 2: p53-fluoreszenzindizes der Zellinie 4197 mit dem p53-antikörper Do-1 (24h Kultur + Bestrahlung + 2h Kultur). Diese graphische Darstellung zeigt, daß für den Ansatz (Röntgenbestrahlung und Inkubation) 4Gy+2h deutlich höhere Fluoreszenzindizes erhalten werden als für die Ansätze 0Gy und 4Gy. Beim Ansatz 4Gy+2h, dessen Fluoreszenzindizes mit steigendem Zellysatvolumen zunehmen, liegt ein Nachweis des induzierten p53-wildtypproteins vor Fluoreszenzmikroskopie Strahleninduzierte p53-mengen der Zellinie 4197 wurden ebenfalls mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie gemessen. Die drei folgenden Bildpaare zeigen die Resultate der Inkubationen mit dem spezifischen Antikörper PAb240 und dem entsprechenden Kontroll-Antikörper (gleicher Isotyp) bei den Behandlungen 0Gy, 4Gy und 4Gy+2h, welche direkt nach einer 24stündigen Zellkultur erfolgten. Abbildung 3: Kontrolle 0Gy. Immunfluoreszenz mit einem Kontroll-Antikörper IgG1 (links) und mit dem p53-antikörper PAb240 (rechts) bei der Zellinie fache Vergrößerung. Unspezifische Fluoreszenz in den Zellen im linken Bild. Spezifische Fluoreszenz im Zytoplasma der Zellen im rechten Bild.

5 Abbildung 4: 4Gy Bestrahlung. Immunfluoreszenz mit einem Kontroll-Antikörper IgG1 (links) und mit dem p53-antikörper PAb240 (rechts) bei der Zellinie fache Vergrößerung. Unspezifische Fluoreszenz in den Zellen im linken Bild. Spezifische Fluoreszenz im Zytoplasma der Zellen im rechten Bild. Abbildung 5: 4Gy + 2h Ansatz. Immunfluoreszenz mit einem Kontroll-Antikörper IgG1 (links) und mit dem p53-antikörper PAb240 (rechts) bei der Zellinie fache Vergrößerung. Unspezifische Fluoreszenz in den Zellen im linken Bild. Spezifische Fluoreszenz im Zytoplasma der Zellen im rechten Bild.

6 Die Unterschiede in der Grünfluoreszenz sind bei allen drei Behandlungen (0Gy, 4Gy und 4Gy+2h), die alle nach einer 24stündigen Zellkultur erfolgten, sehr deutlich und offenbaren den positiven p53- Nachweis. Vergleicht man zudem die Grünfluoreszenz der Inkubationen mit dem spezifischen Antikörper PAb240, so wird klar, daß die Bestrahlung mit 4Gy Röntgenstrahlen sowie die zusätzliche Zeit von 2 Stunden zu gesteigerter Grünfluoreszenz führen (strahleninduzierte p53-menge). Auf allen diesen Fotografien sind lediglich grün fluoreszierende Bereiche im Zytoplasma zu erkennen, dagegen sind die Zellkerne weitgehend frei von deutlicher Grünfluoreszenz DISKUSSION Die strahleninduzierte Induktion des p53-proteins nach Röntgenstrahlung wurde erstmals 1991 von Kastan et al. nachgewiesen (Fehler! Textmarke nicht definiert.). In der anschließenden Zeit konnte die Induktion von funktionellem p53-wildtypprotein bei unterschiedlichen Zelltypen und mit verschiedenen Methoden gezeigt werden. Der p53-nachweis mit Hilfe der Durchflußzytometrie stellt dabei eine sehr schnelle und leicht einzusetzende Methode, bei der in wenigen Sekunden einige Hundert Zellen gemessen werden können, dar. Einige Autoren stellen fest, daß nicht alle p53-wildtypproteine nach Bestrahlung induzierbar sind. Die Darstellung der Fähigkeit zur Induktion ist daher sehr komplex und wird wahrscheinlich entscheidend von der verwendeten Nachweismethode und vor allem von den eingesetzten Antikörpern abhängig sein. Mit dem Antikörper Do-1, der in der Durchflußzytometrie und der Fluoreszenzmikroskopie keinen Nachweis des strahleninduzierten p53-wildtypproteins erlaubte, konnte im Western blot ein Nachweis erbracht werden. Möglicherweise scheint gerade dieser Antikörper beim Western blot das Epitop auf dem p53-protein, gegen das er gerichtet ist, besonders gut zu erkennen. Ergänzend sollte dabei aber nicht außer Acht gelassen werden, daß die Bindungsfähigkeit eines Antikörpers, zusätzlich zu den methodischen Bedingungen, auch vom Zelltyp bzw. von der zellulären Situation in der sich die Zelle befindet abhängt. In der Literatur wird meistens eine Induktion der p53-akkumulation beschrieben, welche primär im Zellkern stattfindet (i). Das hier beschriebene Ergebnis kann dagegen dokumentieren, daß das induzierte p53-protein bei der Plattenepithelkarzinom-Zellinie 4197 im Zytoplasma lokalisiert ist. Bei der p53-wildtypzellinie 4197 scheint somit das konstitutive und induzierte p53-protein, nachgewiesen mit dem Antikörper PAb240, primär im Zytoplasma lokalisiert zu sein. Der positive Nachweis des konstitutiven ( normalen ) p53-proteins im Zytoplasma, mit dem Antikörper PAb240 und der Fluoreszenzmikroskopie, konnte hier erstmals erbracht werden. Die zellphysiologischen Gegebenheiten sind nicht bei allen p53-wildtyp exprimierenden Zelltypen und Tumorzellinien gleich und können die verschiedenen Reaktivitäten des Antikörpers PAb240 erklären. Die Darstellbarkeit des konstitutiven sowie des induzierten p53-proteins mit dem Antikörper PAb240 steht nicht im Widerspruch zu einer Promotorfunktion, die mit dem Nachweis durch den Antikörper PAb240 in Zusammenhang gebracht wird. Wie schon im Abschnitt erwähnt, besteht

7 möglicherweise zwischen verschiedenen Antikörperreaktivitäten und bestimmten p53-funktionen eine Verbindung. Cooper et al. (1993) formulieren die Hypothese, daß eine positive Reaktivität des Antikörpers PAb240 eine Promotorfunktion des p53-proteins nachweist (ii). Somit kann in diesem Fall des Wildtypnachweises unter konstitutiven und induzierten Bedingungen ebenfalls der Nachweis einer Promotorfunktion in Betracht gezogen werden. Daher ist es verständlich, daß die Reaktionen der Wildtypproteine mit ein und demselben Antikörper nicht immer zwangsläufig zum gleichen Ergebnis führen müssen. Letztendlich entscheidet natürlich auch die Verschiedenartigkeit der einzelnen Zelltypen und des zellulären Mikromilieus über eine nähere Identifizierung eines p53-proteins bzw. einer p53-funktion. i. Fritsche M., Haessler C. und Brandner G. Induktion of nuclear accumulation of the tumorsuppressor protein p53 by DNA-damaging agents. Oncogene 8, , 1993 ii. Cooper K., Herrington C.S., Evans M.F., Gatter K.C. und McGee J.O. P53 antigen in cervical condylomata, intraepithelial neoplasia, and carcinoma: relationsship to HPV infection and integration. J. Pathol. 171, 27-34, 1993