VERSUCH 4: BASOPHIL ACTIVATION TEST

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1 VERSUCH 4: BASOPHIL ACTIVATION TEST LERNZIELE: 1) IgE Status allergischer vs. naiver Mäuse mittels Basophil Activation TEST 2) Auswertung von FACS Daten mittels Cyflogic Software 3) Statistischer Vergleich zwischen den Gruppen HINTERGRUND: VORBEMERKUNG: In diesem Übungsbeispiel werden sie allergenspezifische IgE Antikörper in sensibilisierten vs. naiven Mäusen mittels eines Basophil Activation Assays (BAT) nachweisen. Im Gegensatz zu Assays, die IgE im Serum oder Plasma nachweisen (diese Assays werden sie nächste Woche kennenlernen), wird hier zellgebundenes IgE nachgewiesen. IMMUNOGLOBULIN E: IgE ist eine Antikörpersubklasse, die für anaphylaktische Immunreaktionen verantwortlich ist. Anaphylaxie ist eine heftige immunologische Reaktion, bei der eine Vielzahl an pro-inflammatorischen Mediatoren und Zytokinen ausgeschüttet wird. Die eigentliche Funktion von IgE ist ein kontrovers diskutiertes Thema, in der Regel wird diese Antikörperklasse als Abwehrsystem gegen parasitäre Erkrankungen angesehen. Heute wird IgE vor allem im Kontext von Allergie genannt, da es das entscheidende Molekül für die Entstehung von Typ I Allergien ist. Im Serum ist die Halbwertszeit von freiem IgE sehr gering (ca. 6h) und es liegt nur in geringen Konzentrationen vor. Im Gegensatz dazu, liegt die Halbwertszeit von an Zellen gebundenem IgE bei Wochen bis Monaten. Das meiste IgE im

2 Körper ist in den Epithelien und in der Mucosa an Mastzellen und Eosinophile Granulozyten über IgE Rezeptoren (Fc RI und Fc RII). Im Blut liegt das IgE v.a. an Basophile Granulozyten gebunden vor. Aus diesem Grund ist die Bestimmung von freiem IgE im Serum problematisch, da es nicht unbedingt die Situation im Organismus wiederspiegelt. Mittels eines BAT kann man nun direkt aus dem Blut antigenspezifisches IgE welches an die Fc RI auf der Oberfläche der Granulozyten gebunden ist nachweisen. AKTIVIERUNG VON BASOPHILEN GRANULOZYTEN Wie sie sich vom ersten Übungsbeispiel erinnern können, reagieren Basophile Granulozyten auf Quervernetzung des gebundenen IgE mit Degranulierung. Da wir die Degranulierung im FACS jedoch nur schwer nachweisen können, werden wir für diesen Assay einen anderen Marker verwenden. In humanen Basophilen verwendet man hierfür die Oberflächenmarker CD69, CD203c oder CD300a. Diese Marker werden nach Aktivierung schnell hochreguliert und können dann im FACS analysiert werden. Leider werden diese Marker in murinen Basophilen nicht exprimiert. Allerdings konnte vor kurzem ein neuer Marker CD200R identifiziert werden, der sowohl auf humanen als auch murinen Zellen stark exprimiert wird und nach Aktiverung hochreguliert wird. ABB.1 BASOPHIL ACTIVATION TEST. Quervernetzung von zellgebundenem IgE führt zur Hochregulation von CD200R, CD203c und CD300a.

3 Im Praktikum werden wir die Blutproben aus sensibilisierten Mäusen und naiven Mäusen mit dem Gräserpollen Allergen Phl p 5 inkubieren. Wenn auf den Basophilen im Blut Phl p 5 spezifisches IgE gebunden ist, wird es durch das Allergen quervernetzt und der Basophile Granulozyt wird aktiviert. Als positiv Kontrolle verwenden wir einen anti-mouse IgE Antikörper, der die IgE Antikörper unabhängig von ihrer Spezifität quervernetzen kann. IHRE AUFGABEN: 1. Aktivieren sie die Basophilen Granuolzyten durch Zugabe von Allergen bzw. anti-mouse IgE 2. Bestimmen sie Expression des Aktivierungsmarkers CD2ooR. 3. Sammeln sie die Ergebnisse der anderen Gruppen und machen sie eine statistische Auswertung. Unterscheiden sich die Aktivierung der Basophilen in allergischen Mäusen von denen der nicht-allergischen Mäuse? DURCHFÜHRUNG DES EXPERIMENTS: Aktivierung der Basophilen 1. Sie bekommen frisches, heparinisiertes Maus-Vollblut von jeweils einer sensibilisierten und einer naiven Maus. Notieren sie sich die Nummern ihrer Blutproben. 2. Zur Re-stimulation der Basophilen in den Blutproben erhalten sie folgende Lösungen: a. Stimulationsmix: 100µL RPMI mit 40µg/mL rekombinantem Phl p 5 b. Negativkontrolle: 100µL RPMI c. Positivkontrolle: 100µl RPMI mit 1µg/mL anti-mouse IgE 3. Re-suspendieren sie ihre Blutproben durch Auf- und Abpipettieren.

4 4. Mischen sie jeweils 50µL Blutprobe mit 50µL von ihren unter Punkt2 hergestellten Lösungen in der V-bottom Platte. Sie haben jetzt insgesamt 6 Proben (je 3 Proben pro Blutprobe). Teilen sie sich eine Platte mit der Nachbargruppe. ABB.1 AUFTRAGSCHEMA. 2 Gruppen teilen sich eine V-bottom Platte zum Inkubieren der Blutproben 5. Inkubieren sie die Proben 1h bei 37 C. 6. In dieser Zeit werden die Basophilen aktiviert, sofern ihre Oberflächenrezeptoren quervernetzt werden. Im Fall vom Stimulationsmix, sollte das nur passieren, wenn die Maus auch Phl p 5 spezifische IgE hat, die jetzt vom Allergen quervernetzt werden (die sensibilisierte Maus). Bei der Positivkontrolle sollte das immer passieren, da hier die IgE durch einen sekundären Antikörper quervernetzt werden (irgendwelche IgE sind immer vorhanden, auch in einer naiven Maus). Oberflächenfärbung

5 1. Stellen sie 180µL von folgendem Färbemix in FB her. Sie bekommen bereits 1:10 vorverdünnte Antikörper: a. Anti-mouse CD200R-APC 1:200 b. Anti-mouse IgE-FITC 1:200 c. Anti-mouse CD19-PE/Cy7 1:200 d. Anti-mouse CD4-PerCp/Cy5.5 1: Sobald die Stunde Inkubationszeit um ist, zentrifugieren sie ihre Blutproben 10min bei 1200rpm bei RT. 3. Dekantieren sie die Platte (mit Schwung aus dem Handgelenk) ins Waschbecken und klopfen die Platte anschließend sanft auf einigen Lagen Küchenrolle ab. 4. Re-suspendieren sie die Pellets in jeweils 30µL Färbemix. 5. Stellen sie ihre Probe 10min in den Kühlschrank. Die Antikörper binden jetzt an die entsprechenden Oberflächenantigene. 6. Geben sie 100µl FB zu (waschen) 7. Zentrifugieren sie 5min bei 1200rpm bei RT. 8. Dekantieren sie die Platte wie unter Schritt Re-suspendieren sie das Pellet gründlich in 100µL FACS-Lyse. Diese hypotone Salzlösung lysiert die Erythrozyten. 10. Inkubieren sie 5min bei RT. Die Probe sollte bei erfolgreicher Lyse klar werden (klar als Gegenteil von trüb. Die Probe ist trotzdem rot, da das Hämoglobin aus den lysierten Erythrozyten ja nach wie vor in der Lösung ist) 11. Zentrifugieren sie 5min bei 1500rpm bei RT. 12. Dekantieren sie die Platte wie unter Schritt Resuspendieren sie das Pellet in 100µL FB. 14. Zentrifugieren sie 5min bei 1500rpm bei RT. 15. Dekantieren sie die Platte wie unter Schritt Wiederholen sie die Schritte Das Pellet sollte jetzt nicht mehr rot, sondern weiß (und sehr viel kleiner) sein. Wenn ihr Pellet noch rot ist, war die Lyse nicht vollständig -> Wiederholen sie Schritt Re-suspendieren sie ihr Pellet in 100µL FACS buffer und überführen sie die Probe in ein FACS-Tube.

6 19. Gehen sie mit ihrer Probe zum LV-Leiter um sie im FACS zu messen. 20. Speichern sie ihre Daten auf einen USB Stick Auswerten ihrer Ergebnisse mit der Cyflogic Software Wir gehen nun Schritt für Schritt die Auswertung Ihrer Proben durch. Die im Skript gezeigten Daten stehen auch als Basophils.fcs zum Download bereit. 1. Starten sie die Cyflogic Software und öffnen sie ihr erstes File. 2. Setzen sie ein Gate auf die Lymphozyten im FSC/SSC Diagramm (die Basophilen befinden sich auch in diesem Bereich). 3. Öffnen sie einen zweiten Plot und zeigen sie auf der X-Aches die anti-ige Färbung an (FITC) und auf der Y-Achse die CD19 Färbung (PE/Cy7). 4. Klicken sie auf den rechten Plot mit der rechten Maustaste und lassen sie sich nur die Zellen im Lymphogate anzeigen. a. Sie sollten jetzt die Basophilen als abgegrenzte Population erkennen. b. Auch einige wenige B-Zellen (CD19+) exprimieren IgE. Markieren sie nur die CD19- IgE+ Zellen (die Basophilen) c. Sie können das Lymphogate im linken Plot verschieben oder verändern und bekobachten, wie sich der rechte Plot verändert. Optimieren sie so die Darstellung der Basophilen im rechten Plot.

7 5. Wiederholen sie Punkt 4, nur stellen sie diesmal die CD4+ T Zellen auf der Y-Achse dar (PerCp/Cy5.5). a. Auch manche T-Zellen können IgE über den low-affinity IgE Rezeptor (CD23) binden. Markieren sie wiederum nur die CD4- IgE+ Zellen (die Basophilen)

8 6. Wenn sie eine saubere Population an Basophilen erkennen, geben sie eine entsprechende Definition ein (Lymphogate and Basophils_1 and Basophils_2). 7. Öffnen sie einen weiteren Plot und tragen sie auf der X-Achse den SSC auf und auf der Y-Achse die CD200R Färbung (APC). Lassen sie sich in diesem Plot nur die Basophilen anzeigen (die sie in Schritt 6 definiert haben). 8. Öffnen sie das Statistikfenster für diesen Plot. In diesem Fall interessiert uns die Durchschnittliche Fluoreszenzintensität von APC (MFI mean fluorescence intensity). Da die Fluoreszenzintensitäten wegen der breiten Streuung in der Regel logarithmisch aufgetragen werden, verwenden wir den geometic mean, der dem Mittelwert der logarithmisch dargestellten Werte entspricht. Die MFI korreliert mit der Menge der CD200R Moleküle auf der Zelloberfläche, die wir ja mit einem anti-cd200r-apc Antikörper markiert haben. Die Anzahl der CD200R Moleküle auf der Oberfläche widerspiegelt den Aktivierungsgrad der Basophilen.

9 9. Da in unserem Fall, das CD200R-APC Signal auf der Y-Achse aufgetragen ist, ist das der Y geomean Wert im Statistikfenster (hier 42.73). 10. Werten sie alle ihre Proben mit denselben Gates aus. a. Es wäre nicht zulässig, für jede Probe andere Gates zu setzen, da die Auswahl der Gates das Ergebnis beeinflusst. Wenn alle Proben mit denselben Gates ausgewertet werden, ist es jedoch ein fairer Vergleich. b. Öffnen sie dazu den Filebrowser (View -> Filebrowser). c. Durch Doppelklick auf ein bestimmtes File, wird dieses File in den aktiven Plot geladen. Alle Gates werden übernommen. 11. Sie sollten jetzt folgende Daten über die CD200R MFI haben (vervollständigen Sie die Tabelle): Phl p 5 stimuliert Unstimuliert Anti-Fc RI stimuliert

10 sensibilisiert naiv Auswerten ihrer Ergebnisse mit der Cyflogic Software Zuletzt werten wir wieder die Daten von allen Gruppen gemeinsam statistisch aus. Insgesamt gibt es Proben von 5 sensibilisierten und 5 naiven Mäusen. Manche Proben wurden auch mehrfach gemessen. 1. Besorgen Sie sich die Ergebnisse der anderen Gruppen 2. Kopieren Sie die Daten in Excel (Microsoft) oder Calc (Open Office). Ein Template liegt zum Download bereit (Basophile_Auswertung.xls). 3. Nutzen sie das Template, um die Diagramme zu erstellen und zu berechnen, ob sich der Aktivierungsstatus der Basophilen Granulozyten zwischen sensibilisierten und naiven Mäusen signifikant unterscheidet. Dazu verwenden wir wiedereinen two-tailed unpaired T-Test. Ein hypothetisches Beispiel sehen sie unten in der Grafik. 4. Bereiten sie für die Abschlussbesprechung eine Powerpoint-Präsentation vor. MATERIAL-LISTE: GERÄTE: Kolbenhub-Pipetten, einstellbar für Maximal-Volumina von 1000, 200 und 20µL. 96-well V-bottom Plate Verdünnte Antikörperlösungen (Anti-mouse CD4 PerCP/Cy5.5, Anti-mouse CD19 PE/Cy7, Anti-mouse IgE FITC, Anti-mouse CD200R APC) jeweils 1:10 in FACS-Buffer Zentrifuge FACS Canto II Durchflusszytometer

11 LÖSUNGEN: FACS Buffer FACS Lyse 1% BSA, 2mM EDTA in PBS gekaufte Fertiglösung