2) Freisetzung von Enzymen aus subzellulären Kompartimenten mittels Detergenzien

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1 VERSUCH 1: ZELL-KULTUR LERNZIELE: 1) Umgang mit Zellkulturen 2) Freisetzung von Enzymen aus subzellulären Kompartimenten mittels Detergenzien 3) Einfluss von Detergens auf die Zell-Vitalität 4) Mitochondriale Aktivität HINTERGRUND: VORBEMERKUNG: Mit diesem Übungsbeispiel wollen wir Ihnen Gelegenheit geben, einige basale Techniken der Zellkultur kennenzulernen. Die Arbeit an lebenden kultivierten Zellen ist in vielen Bereichen der Biologie sehr populär. Lebende Zellen bilden bereits einen Großteil der Komplexität biologischer Systeme ab und ermöglichen Ihnen, komplexe Stoffwechselprozesse, Signaltransduktionswege oder sonstige Reaktionen auf innere oder äußere Einflüsse zu untersuchen. Normalerweise erfordert die Kultur von Zellen spezielle Ausrüstung, wie z.b. Brutschränke mit CO 2 Atmosphäre (wozu?), hoher Luftfeuchtigkeit (wozu?) und konstanter Temperatur (wozu?), Werkbänke mit sterilem Luftstrom und sterile Gefäße und Werkzeuge (wozu?). Aus organisatorischen Gründen können wir Ihnen diese Ausrüstung in den Übungen nicht zur Verfügung stellen. Wir haben aber Ihre Experimente so konstruiert, dass in den vier Stunden Ihres Arbeitens die Zellen auch ohne diese speziellen Voraussetzungen überleben werden. Behalten Sie aber bitte für später in Erinnerung, dass beim Arbeiten mit lebenden Zellkulturen immer auf optimale Umgebungsbedingungen zu achten ist und alles Material unbedingt steril sein muss. DIE ALLERGISCHE REAKTION

2 Die Zellen, die Sie von uns bekommen sind basophile Granulozyten, die vor langer Zeit von irgendjemandem aus einer Ratte mit Leukämie isoliert wurden (rat basophil leukemia cells, die Linie heißt RBL-2H3, aber das ist hier nicht wichtig). Basophile Granulozyten tragen einen Rezeptor für IgE an ihrer Oberfläche, und deshalb sind sie für manche Experimente, die mit allergischen Reaktionen zu tun haben, recht brauchbar. Wie in allergischen Patienten besetzen IgE Antikörper die Fc -Rezeptoren dieser Zellen. Wenn nun Antigene an die Spitzen ( Paratope ) der Antikörper binden und diese quervernetzen (jeder Antikörper hat 2 identische Paratope), dann löst das ein Signal im Inneren der Zellen aus, das dazu führt, dass Granula mit der Zellmembran fusionieren und ihren Inhalt aus der Zelle ins Medium (bzw. beim Patienten ins Blut oder Gewebe) ausschütten. ABB.1 DIE ALLERGISCHE IMMUNREAKTION. Allergene werden im Körper von Antigen präsentierenden Zellen (APCs) aufgenommen [1], und in Peptide prozessiert, die danach auf MHC II an T Zellen präsentiert werden [2]. Dies führt in atopischen Individuen (Personen mit erhöhtem IgE Spiegel, die ein erhöhtes Risiko tragen, Allergien zu entwickeln) zur Bildung von Antigen spezifischen Th2 Zellen (Th2), die bestimmte Zytokine wie z.b. IL-4 produzieren, was wiederum zum class-switch auf IgE in B-Zellen (B) führt [3]. Sekretierte IgE Moleküle binden an Fcε Rezeptoren auf der Oberfläche von Mastzellen und basophilen

3 Granulozyten. Quervernetzung der Rezeptoren bei erneutem Allergenkontakt führt zur Freisetzung von Mediatoren [4], die die typischen Symptome von Typ I Allergie (IgE vermittelter Allergie) auslösen. In den Bronchien führt die Bindung von Allergenen an IgE auf Mastzellen ebenso zur Degranulation (early phase) [5]. Mastzell-Mediatoren fördern auch die Schleimbildung durch Becher Zellen (Goblet cells - GC) [6] und die Infiltration der Lunge durch eosinophile Granulozyten (Eos) [7] und Th2 Zellen, die nach Aktivierung große Mengen an IL-5 und IL-13 produzieren [8], was wiederum die Reifung und Infiltration von Eosinophilen begünstigt (late-phase). Degranulation von Eosinophilen führt zu Schäden am vaskulären und bronchialen Epithel und verschlimmert die asthmatischen Symptome [9]. BASOPHIL RELEASE ASSAY Diese Granula enthalten alle möglichen Stoffe, die letztlich die bekannten Symptome einer Allergie hervorrufen (Histamin, verschiedene Arachidonsäurederivate, Enzyme, etc.). Wichtig für Ihren Versuch ist ein Enzym namens beta-hexosaminidase, das im Zuge der Degranulation freigesetzt wird. Es kann bestimmte Zuckergruppen z.b. von Gangliosiden abspalten und spielt z.b. in der Abwehr von mykobakteriellen Infektionen eine Rolle. Wir messen das Enzym im Medium von RBL-Zellen nur, um IgE-mediierte Degranulation nachzuweisen. Als Null-Punkt messen wir die Enzymaktivität im Medium von unbehandelten Zellen, und als 100%-Wert den Überstand von Zellen, die wir mit dem Detergens Triton X-100 lysiert haben. Das ist natürlich keine physiologische Degranulation, und die Zellen sterben dabei auch. Aber wir erhalten einen Wert für die theoretisch maximal freisetzbare Menge an beta-hexosaminidase.

4 ABB.2 BASOPHIL RELEASE ASSAY. Rat basophil leukemia cells (RBL) können durch Zugabe des Detergens Triton X 100 lysiert werden, worauf beta-hexosaminidase aus den Granula freigesetzt wird. Durch Zugabe des Substrates 4-NAG kann das Enzym nachgewiesen werden. Beta-Hexosaminidase spaltet 4-NAG wodurch es zu einer Verschiebung des Absorptionsmaximums kommt, die im Photometer bei 405nm gemessen werden kann. ZELLVITALITÄT MITTELS MTT ASSAY Weiters werden Sie in diesem Kurs die Vitalität Ihrer Zellen bestimmen. In unseren Labors messen wir die Zellvitalität gerne mittels MTT Reduktion. MTT, 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide ist eine Verbindung, die in funktionell intakten Mitochondrien und im endoplasmatischen Retikulum zu einem blauen Farbstoff reduziert wird. Im Mikroskop können Sie nach einer Weile sehr schön dunkle Mitochondrien sehen. Aber zum Messen müssen Sie den Farbstoff auflösen und photometrisch quantifizieren. Eine Kultur, die zu 100% aus lebenden Zellen besteht, wird dabei die stärkste Farbentwicklung zeigen. Wenn Zellen sterben, bricht sehr schnell das elektrochemische Potential über der Mitochondrienmembran zusammen, und die Mitochondrien verlieren ihr Redoxpotential (auch

5 wenn sie noch völlig intakt aussehen). Dadurch wird MTT nicht mehr reduziert und die Zelle bleibt farblos. ABB.3 MTT ASSAY. MTT wird in lebenden Zellen in Mitochondrien zu einem blauen Farbstoff reduziert, der im Photometer bei 595nm nachgewiesen werden kann. In toten Zellen bricht das Redoxpotential der Mitochondrien zusammen und es kommt zu keiner Farbstoffreduktion. Die Stärke der Blaufärbung ist daher ein Maß für die Stoffwechselaktivität der Zelle. BESTIMMUNG DER ZELLZAHL Für Ihre Assays müssen Sie die Menge der eingesäten Zellen kennen. Dazu bestimmen Sie die Zellkonzentration mittels einer Neubauer Zählkammer. Normalerweise bestehen diese Zählkammern aus Glas mit einem zentralen Messfeld, das mit einem Deckglas abgedeckt wird.

6 Bei uns erhalten Sie Zählkammern aus Plastik mit zwei Messfeldern, die fix abgedeckt sind. Sie brauchen daher kein Deckglas mehr. Neben jedem Messfeld ist ein Injektionsbereich, in den Sie 10µL Ihrer Zellsuspension pipettieren. Die Flüssigkeit wird dann von selbst in die Kammer gezogen. ABB.4 NEUBAUER ZÄHLKAMMER. Auf den Injektionsbereich werden 10µL Zellsuspension aufgetragen, die automatisch in die Kammer gezogen werden. Im Messbereich können dann im Mikroskop die Zellen gezählt werden. Der Messbereich besteht aus 3x3 Großquadraten. Jedes Großquadrat beinhaltet ein Volumen von 0.1µL. Das Großquadrat in der Mitte der Zählkammer ist weiter unterteilt in 5x5 Kleinquadrate, von denen wiederum jedes aus 4x4 Kleinstquadraten besteht.

7 ABB.5 NEUBAUER ZÄHLKAMMER. Zentrales Großquadrat, unterteilt in Klein- und Kleinstquadrate. ABB.6 L-ZÄHLMETHODE. Um Zellen nicht doppelt zu zählen werden in jedem Kleinstquadrat nur jene Zellen gezählt, die mit vollem Umfang innerhalb der Begrenzung liegen, oder auf der linken oder unteren Linie ( L ) liegen. Insgesamt sollten mindestens 100 Zellen gezählt werden.

8 ABB.7 ÜBUNGSAUFGABE Wie viele Zellen pro ml haben Sie im oben abgebildeten Beispiel? 1 Großquadrat beinhaltet 0.1mm 3 oder 0.1µL. Daher entsprechen die gezählten Zellen x 10 der Anzahl der Zellen pro µl. IHRE AUFGABEN: 1. Sie sollen herausfinden, wie viel Triton notwendig ist, um die maximal mögliche Menge an beta-hexosaminidase freizusetzen. 2. Außerdem sollen Sie untersuchen, wie viel Triton die Zellen aushalten, ohne zu sterben. Oder, genauer gesagt, wie viel Triton erforderlich ist, damit 50% der Zellen sterben. Da solche Dosis-Wirkungs-Beziehungen sich meist asymptotisch einem Grenzwert annähern, ist die Bestimmung der halbmaximalen Wirkung für Vergleichszwecke oft aussagekräftiger. Sie lesen dann EC50 (effective concentration for 50%), ED50 (effective dose), LD50 (lethal dose). DURCHFÜHRUNG DES EXPERIMENTS: Lesen Sie die Arbeitsvorschrift vollständig und beginnen Sie erst zu arbeiten, wenn Sie sicher sind, alles richtig verstanden zu haben. Kontrollieren Sie anhand der nachstehenden Materialliste, ob alles was Sie brauchen an Ihrem Platz vorhanden ist.

9 A. ERNTEN der ZELLEN: 1) Stellen Sie Medium, Tyrode s Puffer und Trypsin/EDTA im 37 C Wasserbad vor Gebrauch warm. 2) Kontrollieren Sie am Mikroskop den Zustand der Zellen (Dichte, Form, Kontaminationen, etc.) 3) Entfernen Sie das Medium von den Zellen und waschen Sie die Schale: Sie pipettieren dazu vorsichtig (am besten langsam gegen die vertikale Schalenwand) 10 ml DPBS, schwenken die Schale etwas, um die Mediumsreste von den Zellen zu spülen und entfernen die Lösung. Wiederholen Sie den Vorgang. ABB.8 DEKANTIEREN UND WASCHEN. Nach vorsichtigem Absaugen des Mediums werden die Zellen zweimal mit 10mL DPBS gewaschen. Das DPBS kann einfach dekantiert werden. 4) Pipettieren Sie 2 ml Trypsin/EDTA auf die Schale und stellen Sie diese für 7 min in den 37 C Schrank. Kontrollieren Sie am Mikroskop, ob sich die Zellen vom Schalenboden lösen oder abrunden. Durch vorsichtiges Klopfen gegen den Schalenboden können Sie das Ablösen der Zellen unterstützen. Die Zellen sollten sich nun durch kräftiges Spülen mit der Pipette von der Schale lösen lassen. Wenn das keine (oder zu geringe) Wirkung zeigt, stellen Sie die Schale nochmal für 2 min in den Schrank. ABB.9 TRYPSINISIEREN DER ZELLEN. Durch Zugabe von Trypsin/EDTA werden die Zellen von der Kulturschale gelöst. 5) Transferieren Sie die Zellsuspension in ein 15mL Zentrifugenröhrchen und stoppen Sie die Trypsinreaktion durch Zugabe von 7 ml Medium. Das fötale Kälberserum im

10 Medium enthält einen Trypsin-Inhibitor und außerdem eine hohe Konzentration anderer Proteine, die durch ihren Überschuss die Wirkung von Trypsin auf die Zellproteine abschwächen. 6) Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei 167 x g (1200 rpm), entfernen Sie das Medium und resuspendieren Sie das Zellpellet in 2 ml vorgewärmtem Tyrode s Puffer. ABB.10 ABZENTRIFUGIEREN DER ZELLEN B. EINSÄEN DER ZELLEN 1) Transferieren Sie 1,5 ml der Zellsuspension in ein neues Röhren und pipettieren Sie 2,25 ml Tyrode s Puffer dazu (entspricht einer 1 : 2,5 Verdünnung der Zellen). Resuspendieren Sie die Zellsuspension gut! ABB.11 TRANSFER DER ZELLSUSPENSION. Transferieren Sie 1.5mL der Zellsuspension in ein neues Röhrchen und pipettieren Sie 2.25mL Tyrode s Puffer dazu. Der Rest der Zellsuspension wird aufgehoben. 2) Pipettieren Sie davon 100µL pro well in Ihre F96-Platte. Füllen Sie die wells so:

11 Well 2 10 der Reihen B D. Stellen Sie die Platte für 45 min in den 37 C Schrank. Die Zellen sollen in dieser Inkubationsphase Zeit haben sich zu setzen was im Fachjargon adhärieren heißt. ABB.12 ZELLEN EINSÄEN. Pipettieren Sie 100µL Ihrer Zellsuspension in die wells 2-10 in Reihe B-D. C. ZELL-ZÄHLUNG 1) Laden Sie die Neubauer-Zählkammer mit ca. 10 L der unverdünnten Zellsuspension (Sie sollten davon noch ca. 500 µl haben) und zählen Sie am Mikroskop in einem geeigneten (d.h. der Zelldichte angemessenen) Rasterfeld die Zellen. Zählen Sie so viele quadratische Felder aus, bis Sie mindestens 100 Zellen gezählt haben. 2) Berechnen Sie über die Fläche der ausgezählten Quadrate und die Höhe des Kammerspaltes (0.1mm) das Volumen der ausgezählten Suspension. Geben Sie die daraus erhaltene Zelldichte als Anzahl der Zellen pro ml an und ermitteln Sie wie viele Zellen Sie tatsächlich pro well eingesät haben. D. ZELL-LYSE MITTELS TRITON 1) Bereiten Sie eine 1:2 Verdünnungsreihe von Triton X-100 in Tyrode s Puffer, die den Bereich von 0.5% 0.004% umfasst. Stellen Sie von jeder Konzentration 0.5mL her. (TIPP: Sie bekommen von uns eine 10%ige Triton-Lösung. Verdünnen Sie diese Lösung mit Tyrode s Puffer so, dass Sie 1 ml einer 0.5% Lösung erhalten. Legen Sie in allen weiteren Eppis jeweils 0.5 ml Puffer vor; geben Sie 0.5 ml der 0.5%igen Triton-Lösung ins erste Eppi (das gibt 0.25%iges Triton). Mischen Sie und geben Sie dann davon 0.5 ml ins nächste Eppi (gibt %) usw...)

12 2) Kontrollieren Sie am Mikroskop, ob die Zellen am Boden adhäriert haben und ob sich ihre Form verändert hat. 3) Geben Sie dann 100 L Triton-Verdünnung in jeweils 3 untereinanderliegende wells (also von der 0.5%igen Lsg. in die 3 wells der Reihe 2, der 0.25%igen in Reihe 3, der 0.125%igen in Reihe 4 etc. etc.). Beachten Sie, dass Sie 100 l Triton-Verdünnung jeweils zu 100 L der eingesäten Zellen pipettieren d.h. Sie verdünnen Ihre Tritonlösung jeweils um den Faktor 2. In die wells Nr. 10 der Reihen B D werden als Negativ Kontrolle jeweils nur 100 L Tyrode s Puffer ohne Triton pipettiert. ABB.13 ZUGABE VON TRITON X-100. Pipettieren Sie 100µL der jeweiligen Triton Verdünnung in 3 untereinander liegende wells. In Reihe 10 kommt nur Tyrode s Puffer. 4) Mischen Sie die Tritonlösungen mit den Zellen durch vorsichtiges Schütteln am Platten-Schüttler. Vermeiden Sie unbedingt, dass Lösung in benachbarte wells spritzt. 5) Inkubieren Sie Ihre Platte nochmal 10 min bei 37 C im Schrank. 6) Bereiten Sie währenddessen MTT-Lösung vor: Sie benötigen 100µL pro well; die Konzentration an MTT sollte 0.5mg/mL betragen. E. MESSEN des EFFEKTS 1) Kontrollieren Sie am Mikroskop Ihre Zellen. Notieren Sie, was Sie bei den einzelnen Triton-Konzentrationen beobachten. Versuchen Sie abzuschätzen, wie viele Zellen (in %) vital aussehen. 2) Zentrifugieren Sie die Zellen 5 min bei 1200 rpm.

13 3) Übertragen Sie 50 L des Überstandes well für well in die untere Plattenhälfte. Pipettieren Sie (VORSICHTIG! Keine Zellen mitnehmen) den gesamten restlichen Überstand ab und verwerfen Sie ihn. Geben Sie SOFORT 100µL MTT-Medium auf die Zellen. Tipp: Arbeiten Sie zu zweit, um die Zeit, in der die Zellen ohne Flüssigkeit sind, zu minimieren. ABB.14 ÜBERSTAND ÜBERTRAGEN. Übertragen Sie 50µL Überstand well für well in die untere Plattenhälfte. ABB.15 ÜBERSTAND ABHEBEN. Heben Sie den restlichen Überstand komplett ab und pipettieren Sie 100µL MTT auf die Zellen. 4) Pipettieren Sie 50µL 4-NAG zu den Überständen, schütteln Sie die Platte am Platten-Schüttler und inkubieren Sie die Platte 30 min bei 37 C im Wärmeschrank.

14 ABB.16 ZUGABE VON 4-NAG. Pipettieren Sie 50µL 4-NAG zu den Überständen und inkubieren Sie 30min bei 37 C. 5) Kontrollieren Sie die Zellen im Mikroskop. Was sehen Sie? 6) Pipettieren Sie das MTT-Medium VORSICHTIG (!) von den Zellen und lösen Sie den gebildeten Formazan-Farbstoff durch Zugabe von 100µL DMSO/Glycin aus den Zellen. Lassen Sie dazu die Platte ca. 5 min bei Raumtemperatur am Platten-Schüttler schütteln. Füllen Sie DMSO/Glycin auch in einige unbenutzte wells. Diese benötigen Sie als Blank-Werte für die Auswertung. ABB. 17 LÖSEN DES FORMAZAN-FARBSTOFFES. Heben Sie das MTT-Medium von den Zellen ab und lösen Sie den Farbstoff durch Zugabe von 100µL DMSO/Glycin. Füllen Sie einige unbenutzte wells mit 100µL DMSO/Glycin als Background.

15 7) Pipettieren Sie jeweils 100 L Glycin Puffer (ACHTUNG! Nicht mit DMSO/Glycin verwechseln) in die wells mit der 4-NAG Reaktion und mischen sie am Platten-Schüttler. Sie werden sofort einen Farbumschlag nach Gelb erkennen. ABB.18 ZUGABE VON GLYCIN. Pipettieren Sie 100µL Glycin Puffer zu den wells mit der 4-NAG Reaktion. 8) Messen Sie die Platte bei 405nm (für den bhex Assay) und bei 595nm (für den MTT Assay).

16 ABB.19 MESSUNG IM PHOTOMETER F. AUSWERTUNG bhex-assay: 1) Berechnen Sie aus den Background wells (Reihe 10 enthält nur Tyrodes Buffer + Substrat) den Mittelwert und subtrahieren Sie diesen von allen Einzelwerten 2) Bilden Sie Mittelwerte und Standardabweichungen der O.D. Werte aller Parallelansätze und zeichnen Sie ein Diagramm, in dem Sie diese (auf der Y-Achse) als Funktion der Tritonkonzentration (X-Achse) darstellen. 3) Erreichen Sie im untersuchten Triton-Konzentrationsbereich ein Plateau der bhex-freisetzung? 4) Bestimmen Sie die Triton-Konzentration, die für 50% der maximalen bhex-freisetzung erforderlich sind. ABB.20 EC 50 WERT BERECHNUNG MTT-Assay: 1) Berechnen Sie aus den einzelnen Blankwerten den Mittelwert und subtrahieren Sie diesen von allen Einzelmesswerten. 2) Berechnen Sie aus den Parallelwerten der Kulturen ohne Triton den Mittelwert und setzen Sie diesen gleich 100% Vitalität. 3) Berechnen Sie daraus den Prozentsatz der Vitalität für alle Einzelmesswerte.

17 4) Bilden Sie Mittelwert und Standardabweichung der Parallelwerte und tragen Sie diese in einem Diagramm gegen die Triton-Konzentration auf. 5) Bei welcher Triton-Konzentration sind 100% aller Zellen tot? 6) Bestimmen Sie die Triton-Konzentration, bei der noch 50% aller Zellen leben. ABB.21 LD 50 WERT BERECHNUNG MATERIAL-LISTE: GERÄTE: Kolbenhub-Pipetten, einstellbar für Maximal-Volumina von 1000, 200 und 20µL. Platten-Photometer (405 und 565 od. 595 nm) Wärmeschrank 37 C Wasserbad 37 C Mikroskop mit Phasenkontrast Zentrifugenröhrchen (15mL, blue caps) 96well Flachbodenplatten für Zellkultur Platten-Schüttler Neubauer Zählkammer

18 LÖSUNGEN: Medium (500mL): 350mL MEM 100mL RPMI mL FCS (10%) 4mM L-Glutamine (200mM Stock) 2mM Sodium Pyruvate (100mM Stock) 1% Pen/Strep (stock: U/mL Penicillin, 10mg/mL Streptomycin) Trypsin/EDTA: 0.05% Trypsin, 0.02% EDTA, in Dulbecco s PBS DPBS: Dulbecco s PBS, ready-to-use, PAA Laboratories Triton X-100: 10% in H 2 O MTT: 5mg/mL in DPBS 4-NAG: 100mM Citratpuffer, ph mm 4-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide DMSO-Glycin: 1 vol. 100mM Glycin/NaOH, ph vol. DMSO

19 Glycin-Puffer: 200mM Glycin 200mM NaCl Adjust ph to 10.7 with NaOH