Optimierung eines Zellkultursystems für die Stabilitätstestung des Hepatitis E-Virus
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- Franziska Stein
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1 BUNDESINSTITUT FÜR RISIKOBEWERTUNG Optimierung eines Zellkultursystems für die Stabilitätstestung des Hepatitis E-Virus Reimar Johne, Jörg Hofmann, Eva Trojnar
2 Mögliche Übertragungswege des Hepatitis E-Virus Lebensmittel von Reservoir-Tieren direkter Kontakt Tier-Reservoir? Reisen in Endemiegebiete? Kontamination durch Bewässerung/Düngung Transfusionen Umweltkontamination
3 Mögliche Übertragungswege des Hepatitis E-Virus Wie lange / unter welchen Bedingungen bleibt HEV infektiös??? Lebensmittel von Reservoir-Tieren direkter Kontakt Tier-Reservoir Reisen in Endemiegebiete??? Kontamination durch Bewässerung/Düngung? Transfusionen Umweltkontamination
4 Infektiositätstestung Hepatitis E-Virus - Versuchstier - Zellkultur
5 Hepatitis E-Virus - Zellkultur - kein robustes und effizientes Zellkultursystem vorhanden! - widersprüchliche Befunde: Isolierung und HEV-Wachstum (Tanaka et al. 2007, Takahashi et al. 2010, Zhang et al. 2011, ) keine Isolierung und kein HEV-Wachstum (Schielke et al. 2011, Berto et al. 2013, ) /2012: 2 Berichte über erfolgreiche Anzüchtung von HEV aus chronisch infizierten Patienten in den USA (Shukla et al. 2011, Nguyen et al. 2012) beide Isolate zeigten ungewöhnliche Insertionen im Genom
6 Eigene Versuche der HEV-Anzüchtung in Zellkultur Auswahl der humanen Lungenkarzinom-Zelllinie A549 Inokulation von HEV-positiven Organhomogenaten und Seren Inkubation bei 34,5 C für 7 Wochen täglich Abnahme von Aliquots für HEV-Genomnachweis (RT-qPCR)
7 Eigene Versuche der HEV-Anzüchtung in Zellkultur Auswahl der humanen Lungenkarzinom-Zelllinie A549 Inokulation von HEV-positiven Organhomogenaten und Seren Inkubation bei 34,5 C für 7 Wochen täglich Abnahme von Aliquots für HEV-Genomnachweis (RT-qPCR) HEV RNA (log copies/ml) Leberhomogenat eines Wildschweins d1 d7 d14 d21 d28 d35 d42 d47
8 Eigene Versuche der HEV-Anzüchtung in Zellkultur Auswahl der humanen Lungenkarzinom-Zelllinie A549 Inokulation von HEV-positiven Organhomogenaten und Seren Inkubation bei 34,5 C für 7 Wochen täglich Abnahme von Aliquots für HEV-Genomnachweis (RT-qPCR) HEV RNA (log copies/ml) humanes Serum (akute Hepatitis E) Leberhomogenat eines Wildschweins d1 d7 d14 d21 d28 d35 d42 d47
9 Eigene Versuche der HEV-Anzüchtung in Zellkultur Auswahl der humanen Lungenkarzinom-Zelllinie A549 Inokulation von HEV-positiven Organhomogenaten und Seren Inkubation bei 34,5 C für 7 Wochen täglich Abnahme von Aliquots für HEV-Genomnachweis (RT-qPCR) HEV RNA (log copies/ml) humanes Serum 2 (akute Hepatitis E) humanes Serum (akute Hepatitis E) Leberhomogenat eines Wildschweins d1 d7 d14 d21 d28 d35 d42 d47
10 Eigene Versuche der HEV-Anzüchtung in Zellkultur Auswahl der humanen Lungenkarzinom-Zelllinie A549 Inokulation von HEV-positiven Organhomogenaten und Seren Inkubation bei 34,5 C für 7 Wochen täglich Abnahme von Aliquots für HEV-Genomnachweis (RT-qPCR) HEV RNA (log copies/ml) humanes Serum 2 (akute Hepatitis E) humanes Serum (akute Hepatitis E) Leberhomogenat eines Wildschweins d1 d7 d14 d21 d28 d35 d42 d47 humanes Serum (chronische Hepatitis E) Stamm 47832
11 Wachstum von HEV nach Infektion der Zellkultur 2. Viruspassage 3. Viruspassage HEV RNA (log copies/ml) HEV RNA (log copies/ml) d p.i d p.i.
12 Genomsequenz von HEV Genotyp 3, verwandt mit HEV-Sämmen von Mensch und Wildschwein aus Deutschland
13 Genomsequenz von HEV Genotyp 3, verwandt mit HEV-Sämmen von Mensch und Wildschwein aus Deutschland Insertion von 186 Nukleotiden im ORF1 186 nt (62 aa) [2440] [2555] [5136] [5205] 116 nt (38 aa in frame) 70 nt (24 aa in frame) ORF1 2253/2440 ORF1 ORF1 ORF
14 Genomsequenz von HEV Genotyp 3, verwandt mit HEV-Sämmen von Mensch und Wildschwein aus Deutschland Insertion von 186 Nukleotiden im ORF1 186 nt (62 aa) [2440] [2555] [5136] [5205] 116 nt (38 aa in frame) 70 nt (24 aa in frame) ORF1 2253/2440 ORF1 ORF1 ORF besonderer Stamm, Mechanismus der Zellkultur-Adaption unbekannt
15 Nachweis von HEV in Zellkultur Immunhistochemie, anti-hev HEV-infiziert nicht infiziert
16 Nachweis von HEV Partikeln in Zellkultur Kulturüberstand CsCl-Gradienten- Reinigung Negativkontrastierung Elektronenmikroskopie Coomassie- Färbung Negativkontrastierung Elektronenmikroskopie
17 Optimierung der HEV-Infektion in Zellkultur Probleme: - variabler Verlauf des Viruswachstums nach Infektion - variable End-Virusmenge - Infektion nur mit unverdünntem Kulturüberstand erfolgreich
18 Optimierung der HEV-Infektion in Zellkultur Probleme: - variabler Verlauf des Viruswachstums nach Infektion - variable End-Virusmenge - Infektion nur mit unverdünntem Kulturüberstand erfolgreich Untersuchungen zur Optimierung: andere Zellen: A594 PLC/PR/5 Temperatur: 34,5 C 37 C Zelldichte: dünn konfluent FKS: 2% 10%
19 Herstellung von Zellkultur-Klonen A549-Zellkultur Vereinzelung der Zellen Klon B1 Klon A4 Klon D3 Klon F2 Klon BD3 Infektion mit HEV Real-time RT-PCR-Testung (HEV-Menge)
20 Herstellung von Zellkultur-Klonen A549-Zellkultur Vereinzelung der Zellen Klon B1 Klon A4 Klon D3 Klon F2 Klon BD3 Infektion mit HEV Real-time RT-PCR / IFT-Testung (HEV-Menge)
21 Herstellung von Zellkultur-Klonen HEV-Infektion: A549 A549/D3 A549/DB3 unverdünnt 1:10 verdünnt 1:100 verdünnt nicht infiziert
22 Langzeit-Stabilität von HEV Lagerung von HEV-Stamm bei 4 C, 22 C und 37 C einfrieren bei -80 C Titration in 96 well-platten A549/D3-Zellen IFT nach 14 Tagen und Auszählung Fokus-formender Units (ffu)
23 Hitze-Stabilität von HEV Erhitzung von HEV-Stamm für 1 min einfrieren bei -80 C Titration in 96 well-platten A549/D3-Zellen IFT nach 14 Tagen und Auszählung Fokus-formender Units (ffu)
24 Zusammenfassung Ein HEV-Stamm wurde erfolgreich in der Zellkultur angezüchtet. Der Stamm besitzt eine ungewöhnliche Insertion im Genom. Die HEV-Zellkultur wurde optimiert und die besser infizierbare Sub-Zellinie A549/D3 generiert. Erste Ergebnisse zur Langzeit- und Hitzstabilität von HEV wurden mit diesem System erhalten.
25 Acknowledgements BUNDESINSTITUT FÜR RISIKOBEWERTUNG Federal Institute for Risk Assessment (BfR): Jochen Reetz Jens Hammerl Patrycja Machnowska Jana Sachsenröder Eva Trojnar Silke Apelt Friedrich-Loeffler-Institute (FLI): Rainer Ulrich Charité Medical School: Peter Nickel Jörg Hofmann Federal Institute for Risk Assessment DiedersdorferWeg 1 D Berlin Tel Fax Reimar.Johne@bfr.bund.de
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