PCV-2 in Zellkulturen. Problem bei der Etablierung neuer Erregernachweise?

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1 PCV-2 in Zellkulturen Problem bei der Etablierung neuer Erregernachweise? Dienstsitz Berlin Invalidenstraße Berlin Standort Frankfurt/Oder Gerhard-Neumann-Straße 2/ Frankfurt (Oder) Landeslabor Berlin-Brandenburg und Andreas Hlinak

2 Porcines Circovirus Typ kleines ikosaedrisches Virus mit ssdna Genom - ~ 17 nm Durchmesser - bekannt seit Problem (Krankheitsausbrüche) seit PDNS, PMWS (PCVAD), oft zusammen mit PRRSV ABER: Für den Vortrag ist es primär uninteressant, welches Virus die Etablierung neuer Erregernachweise schwieriger macht. 2

3 PCR nach Brunborg et al - klassische PCR (Ellis, J. et al. (1999)) ORF2, cap-gene, 481 bp - Anfragen bezüglich Quantifizierung Etablierung einer real-time PCR (Brunborg et al. (2004)) ORF2, cap-gene, 84 bp - Sensitivitätstest: real-time sensitiver Verdünnung: positive Probe unverdünnt bis 1: Spezifitätstest Der Beginn einer spannenden Geschichte... 3

4 Spezifitätstest I 1 - Test von Zellkulturen mit DNA- Viren 1. KOP-Zellkultur infiziert mit PHV-1 und PK15-ZK mit PPV K 2 - Test von nicht infizierten Zellkulturen 2. PK15 und KOP nicht infiziert 3. PK15, KOP, SPEV, FHM und MDCK nicht infiziert 3 K - Test von PCV-1 DNA negativ K 4

5 Spezifitätstest II MEM E/H & FKS Test von: - Zellkulturmedien K MEM E und H FKS - Tiergewebe Rind, Schwein, Fisch tierische Gewebe K 5

6 Verifizierung und Sequenzierung - klassische PCR nach Ellis et al. - 2 x 40 Zyklen; 481 bp - MDCK, FHM, SPEV Sequenzierung der Amplifikate Probe Basenpaare Ergebnis SPEV 390 (F) 369 (R) Porcine circovirus 2 capsid gene 100 % 99 % FHM 365 (F) 317 (R) Porcine circovirus 2 capsid gene 100 % 100 % MDCK 389 (F) 369 (R) Porcine circovirus 2 capsid gene 100 % 99 % 6

7 PCV-2 Eintrag bis jetzt noch nicht gefunden! WAS NUN? Test des eingesetzten Trypsins 1. Ausgangsmaterial lyophilisiert 2. Stammlösung für den Einsatz in der Zellkultur 1. real-time PCR 2. klassische PCR & Sequenzierung 3. ELMI nach Konzentration a) Ultrazentrifuge b) Vivaspin Konzentratoren 100 kda und 50 kda 7

8 PCV-2 aus Trypsin - PCR real-time PCR klassische PCR Sequenzierung Kontrolle Trypsin lyophilisiert Trypsin STL Trypsin lyophilisiert Trypsin gelöst Probe Basenpaare Ergebnis Übereinstimmung GenBank Trypsin STL Trypsin Pulver 338 (F) 386 (R) 379 (F) 369 (R) Porcine circovirus 2 ORF2; capsid gene 100 % 99 % AY AY AY AY

9 PCV-2 ELMI ELMI nach Konzentration a) Ultrazentrifuge b) Vivaspin Konzentratoren 100 kda und 50 kda MW (Trypsin) ~ kda MW (PCV) ~ 60 x Cap = 60 x 30 kda ~ 1800 kda Protein sollte die Membran passieren und das Virus darüber festgehalten werden keine PCV-2 Partikel sichtbar Circoviren Proteinaggregate SOLL IST 9

10 Und jetzt? Test eines neuen Trypsins Trypsin-Lösung (Gibco) weiterhin Spuren von PCV-2 deutlich geringere Mengen als in der alten Stammlösung (1) in der Zellkultur nachweisbar (2) in den Zellen nach mehrmaligem Waschen nicht nachweisbar (3) 1 2 PCV-2 befindet sich NICHT in den Zellen! 3 10

11 Fazit - Etablierung neuer Nachweismethoden Auftauchen von Ergebnissen, die man so oft nicht erwartet - Zellkulturmedien und andere Zutaten werden auf vieles freigetestet ABER: nur bekannte oder relevante Krankheitserreger - als das Trypsin hergestellt wurde, spielte PCV-2 keine Rolle - PCV-2 befindet sich NICHT in den Zellen in diesem Falle könnte also das Trypsin in der Zellkultur weiterverwendet werden, solange nicht auf PCV-2 getestet werden soll Überprüfen, welche Folgen solch ein Ergebnis für f alle im Labor verwendeten Methoden hat! 11

12 Danksagung PCR-Arbeitsgruppe des LLBB Carola Barner Cornelia Worreschk Kathrin Krahl PCR-Team des LLBB Andreas Engelhardt Andreas Hlinak 12

13 Trypsin Spaltstellen - Trypsin spaltet Peptidebindungen an der Carboxyl-Seite ( hinter ) von Argininen (Arg, R) und Lysinen (Lys, K) - Außerdem ist eine Spaltung hinter modifizierten Cysteinen möglich - Kapsid Protein (PCV-2) (GenBank: GU ) Aminosäuren; Spaltstellen - 100%ige Spaltstellen (Peptide Cutter; ExPASy.org): 1 MTYPRRRFRR RRHRPRSHLG QILRRRPWLV HPRHRYRWRR KNGIFNARLS 51 RTFGYTVKRT TVTTPSWAVD MMRFKLDDFV PPGGGTNKIS IPFEYYRIRK 101 VKVEFWPCSP ITQGDRGVGS TAVILDDNFV PKANALTYDP YVNYSFRHTI 151 PQPFSYHSRY FTPKPVLDST IDYFQPNNKR NQLWMRIQTS RNVDHVGLGT 201 AFENSKYDQD YNIRVTMYVQ FREFNLKDPP LKP 13