Conformational Flexibility of DNA

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1 Conformational Flexibility of DNA Andriy Marko, Vasyl Denysenkov, Dominik Margraf, Pavol Cekan, Olav Schiemann, Snorri Th. Sigurdsson und Thomas F. Prisner. Seminar: Moderne Anwendungen der Magnetischen Resonanz Vortrag: Henrik Gustmann Oktober

2 2 Inhalt Einleitung und Problemstellung Allgemein: Abstandsmessung mit PELDOR Experimentelles Vorgehen/ Methoden Ergebnisse Zusammenfassung Quellen

3 Einleitung und Problemstellung Dynamisches Verhalten von ds-dna wichtig um Wechselwirkungen zwischen DNA und Proteinen zu verstehen. Replikation, Transkription Modellvorstellung: elastischer Stab Neuste Experimente weichen von klassischer Modellvorstellung ab. 3

4 Einleitung und Problemstellung Rotor bead tracking Experimente Twist-strech coupling Kleinwinkel-Röntgenstreuung (SAXIS) Länge d. ds-dna-moleküls hängt quadratisch von der Anzahl d. Basenpaare (bp) ab. 4

5 Modelle 5

6 Einleitung und Problemstellung Pulsed Elektron-Elektron Double Resonance (PELDOR) Spektroskopie zur Unterscheidung zwischen Modellen A, B und C. Abstandsmessung zwischen Spin-Labeln. Verwendung von neuem Typ von Spin-Labeln. Beschreibung der Dynamik des ds-dna- Moleküls unter natürlichen Bedingungen. 6

7 Allgemein: Abstandsmessung mit PELDOR PELDOR (Pulsed Elektron-Elektron Double Resonance) 7

8 Allgemein: Abstandsmessung mit PELDOR Totzeit freie 4 Puls-Sequenz: 8

9 Allgemein: Abstandsmessung mit PELDOR 9

10 Spin-Label Unelastischer Spin-Label (Ç-Spin) Analog mit Cystein C Basenpaarung mit Guanin G 10

11 Experimentelles Vorgehen Herstellung von 10 verschiedenen ds-dna Oligomeren mit je 2 Spin-Labeln. Annealing von je 2 ss-dna (20-Mere) mit je einem Spin-Label. 11

12 Experimentelles Vorgehen Abstandsmessung (R) mit PELDOR X-Band (9 GHz/0.3 T) G-Band (180 GHz/ 6.4 T) ds-dna in gefrorener, wässrige Puffer-Lsg. bei 40 K. 4-Puls PELDOR Sequenz 12

13 Experimentelles Vorgehen Simulation von PELDOR Time Traces, bei verschiedenen Offset-Frequenzen, für alle drei Modelle auf Basis dieser Parameter: 13

14 Experimentelles Vorgehen Normalisierte PELDOR Time Traces werden auf Basis dieser Formel berechnet: mit: 14

15 Experimentelles Vorgehen Vergleich zwischen den Simulationen und den gemessenen Daten. (Beispiel) 15

16 Ergebnisse und Diskussion Eine vollständige Übereinstimmung zwischen Experiment und Simulation bei allen Time Traces war nur mit Model B möglich. Model B geht davon aus, dass sich der Radius um 0.64 Å (11%) verringert, während die Ganghöhe der Helix konstant bleibt. Nur die Hochfeld G-Band PELDOR Daten ermöglichen den Ausschluss von Verbiegung der ds-dna. 16

17 Ergebnisse und Diskussion 17

18 Ergebnisse und Diskussion 18

19 Zusammenfassung und Ausblick PELDOR-Experimente bei verschiedenen magnetischen Feldern (0.3 und 6.4 T) ermöglichen die Untersuchung der konformationalen Flexibilität von ds-dna-molekülen. Minimale Störung des natürlichen Systems. Hohe Genauigkeit bei der Abstandsbestimmung im Nanometer-Bereich. Unterscheidung zwischen Biegung, Verdrehung und Streckung ist möglich. 19

20 Zusammenfassung und Ausblick Die Ergebnisse ermöglichen die Entwicklung von besseren Modellen für ds-dna Dynamiken. Die neuen Modelle können mittels der PELDOR- Methode getestet werden. Diese Modelle sind wichtig um die Mechanismen von Erkennung und Transkription in Zellen vollständig erklären zu können. 20

21 Quellen Marko, Andriy; Denysenkov, Vasyl; Margarf, Dominik; Cekan, Pavol; Schiemann, Olav; Sigurdsson, Snorri Th. und Prisner, Thomas F. Conformational Flexibility of DNA. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, S Gore, Jeff; Bryant, Zev; Nöllmann, Marcelo; Le, Mai U.; Cozzarelli, Nicholas R. und Bustamante, Carlos DNA overwinds when stretched. Nature 2006, 442, S Gore, Jeff; Bryant, Zev; Nöllmann, Marcelo; Cozzarelli, Nicholas R. und Bustamante, Carlos Mechanochemical analysis of DNA grase using rotor bead tracking. Nature 2006, 439, S Mathew-Fenn, Rebecca S.; Das, Rhiju und Harbury, Pehr A. B. Remeasuring the Double Helix. Science 2008, 322,.S Marko, Andriy; Margraf, Dominik; Cekan, Pavol; Sigurdson, Snorri Th.; Schiemann, Olav und Prisner, Thomas F. Analytical method to determine the orientation of rigid spin labels in DNA. Phys. Rev. 2010, E81, S Schiemann, Olav; Piton, Nelly; Mu, Yuguang; Stock, Gerhard; Engels, Joachim W und Prisner, Thomas F. A PELDOR-Based Nanometer Distance Ruler for Oligonucleotides. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, S Pannier, M.; Veit, S.; Godt, A.; Jeschke, G. und Spiess, H. W. Dead-Time Free Measurement of Dipol-Dipole Interactions between Electron Spins. J. Magn. Reson. 2000, 142, S