Atomic-resolution dynamics on the surface of amyloid-β protofibrils probed by solution NMR

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1 Atomic-resolution dynamics on the surface of amyloid-β protofibrils probed by solution NMR N. L. Fawzi, J. Ying, R. Ghirlando, D. A. Torchia, G. M. Clore, Nature 2011, 480, Moderne Anwendungen der magnetischen Resonanz Jan-Erik Hornung

2 Übersicht Motivation Amyloid-beta 15 N-DEST Ergebnisse 1

3 Motivation Amyloid-beta wurde als eine Ursache für Alzheimer-Krankheit identifiziert Anhäufungen von Amyloid-beta im Gehirn sind neurotoxisch Kinetik der Oligomerenbildung nicht vollständig geklärt Abbildung entnommen aus: H. A. Scheidt, I. Morgado, S. Rothemund, D. Huster, M. Fändrich, Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50,

4 Amyloid-beta Aus Aβ40- und Aβ42-Monomeren bilden sich bei hohen Konzentrationen wurmähnlich Protofibrillen (Aβ40: 270 µm, Aβ42: 160 µm) Gleichgewicht zwischen Monomeren und Protofibrillen Zu hohe Masse für Flüssig-NMR ( MDa), Signal zu stark verbreitert ( dark-state ) Nur mit monomeren Amyloid-beta NMR möglich Untersuchung des Gleichgewichts durch neue dark-state exchange saturation transfer -Methode Abbildung entnommen aus: N. L. Fawzi, J. Ying, R. Ghirlando, D. A. Torchia, G. M. Clore, Nature 2011, 480,

5 15 N-DEST dark-state exchange saturation transfer -Methode erlaubt Messung der Austauschkinetik zwischen freien und an Protofibrillen gebundenen Monomeren durch 2D Flüssig-NMR Basiert auf Senkung der Umorientierungrate nach Bindung von Monomer an Protofibrillenoberfläche Damit verbunden ist eine Erhöhung der transversalen Relaxationsrate ( 15 N-R 2 ) Hohe 15 N-R 2 -Werte erlauben Teilsättigung der 15 N longitudinalen Magnetisierung der Protofibrillen gebundenen Form durch schwaches Radiofrequenzfeld 4

6 NMR-Technik 1. Amid Proton des monomeres Amyloid-beta ist H z magnetisiert 2. Erstes INEPT führt zu 2H z N z Magnetisierung (Punkt a) 3. Zweites INEPT refokussiert zu N z Magnetisierung (Punkt b) 4. Monomer bindet an Protofibrillenoberfläche 5. Teilsättigung der N z Magnetisierung des gebundenen Monomers durch Dauerstrichsättigungspuls bei variablen Offsets (+35 bis -35 khz, 0.9s) und Frequenzen (170 Hz & 350 Hz), Reduktion der N z Magnetisierung, abhängig von Puls und Austauschkinetik 5. Dissoziation, Messung der reduzierten N z Magnetisierung des Monomers durch HSQC 6. Vergleich mit Referenzsystem (reine Monomerenlösung) Abbildung entnommen aus: N. L. Fawzi, J. Ying, R. Ghirlando, D. A. Torchia, G. M. Clore, Nature 2011, 480,

7 Vorraussetzungen dark-state muss ausreichend bevölkert sein ( 0.5%, Aβ40: 6%, Aβ42: 4%) Makromolekül muss hohe Masse besitzen (> 1 MDa) Große Differenz zwischen den transversalen Relaxationsraten Zeitskala des Austauschprozesse ~10 ms bis ~1 s und müssen gleich oder schneller als R 1 der DEST-Nuclei sein app k on k off 6

8 Auswertung 1 H- 15 N Cross-Peaks der Monomerenlösung zeigen scharfes Sättigungsprofil, wenn Sättigungspuls weniger als ±2 khz von 15 N-Resonanzfrequenz entfernt ist (a) Bei Protofibrillenlösung zeigt sich Sättigung schon früher 15 N-DEST Profil abhängig von Aminosäurerest Schmales Profil im N-terminalen Bereich (b) Breites Profil in der Mitte des Proteins (c) Intermediäres Profil in hydrophiler Region und am C-Terminus (d) Mittlere 15 N-R 2 ist von Position des Aminosäurerests abhängig Abbildung entnommen aus: N. L. Fawzi, J. Ying, R. Ghirlando, D. A. Torchia, G. M. Clore, Nature 2011, 480,

9 Modellbeschreibung Gleichgewicht zwischen freien Monomeren und gebundenen Monomeren als Reaktion pseudo-erster Ordnung aus R 2 der Monomeren- und Protofibrillen-Lösungen app k on Zu einfaches Modell: Kann nicht alle experimentellen Daten wiedergeben R 2 als Funktion der Aminosäurerest-Position fehlerhaft Abbildungen entnommen aus: N. L. Fawzi, J. Ying, R. Ghirlando, D. A. Torchia, G. M. Clore, Nature 2011, 480,

10 Verbessertes Modell Unterteilung in 2 gebundene Zustände: 1. angebunden durch AS-Reste die in direktem Kontakt mit Protofibrillenoberfläche stehen (tethered) 2. in direkten Kontakt mit Protofibrillenoberfläche (contact) Grund: R 2 und 15 N-DEST Profil sind restabhängig Zustand wird unabhängig von anderen Resten betrachtet k app on k app off app app k1 ( i) k2 ( i) k k 1 2 Abbildung entnommen aus: N. L. Fawzi, J. Ying, R. Ghirlando, D. A. Torchia, G. M. Clore, Nature 2011, 480,

11 Verbessertes Modell app app K3 ( i) k2 ( i) / k1 ( i) 15 tethered N - R : durchschnittliche Dynamik eines tethered Restes 2 Physikalisch: Flexibilität und Länge des Stücks zwischen tethered Rest i und direkt gebundenem Rest app on Modeldaten Vergleichsdaten k ) Aβ40 (270 µm) 3.0 ± 0.7 s s -1 k off Aβ40 (270 µm) 51 ± 12 s s -1 ( 1 H Exp.) app k on Aβ42 (160 µm) 2.4 ± 1.8 s s -1 k off Aβ42 (160 µm) 62 ± 46 s -1 ( R ( R max 2 max 2 ) Abbildung entnommen aus: N. L. Fawzi, J. Ying, R. Ghirlando, D. A. Torchia, G. M. Clore, Nature 2011, 480,

12 Ergebnisse C-Terminale Region: 15 N - R tethered 2 Werte für Aβ42 deutlich höher C-Terminale Reste im tethered Zustand unflexibler als Aβ40 Unterschiede als mögliche Erklärung für die schnellere Bildung von Protofibrillen und Fibrillen bei Aβ42 Reste Aβ42 : mehr tethered Monomere können Hairpin und β-faltblattstruktur bilden schnellere Aufnahme von oberflächengebundenen Monomeren in den Protofibrillenkern Abbildung entnommen aus: N. L. Fawzi, J. Ying, R. Ghirlando, D. A. Torchia, G. M. Clore, Nature 2011, 480,

13 Zusammenfassung Erfolgreiche Demonstration der neuen DEST-Methode zur Charakterisierung von Systemen bei denen Monomere im Austausch mit einem gebundenen Zustand an Makromolekül stehen Entwicklung eines Modells für die Bindung von Aβ-Monomeren an Protofibrillen Messung der Austauschkinetik von einzelne Aminosäureresten Mögliche Erklärung für die schnellere Bildung von Aβ42-Protofibrillen im Vergleich zu Aβ40 12

14 Outlook Weitere Anwendung von DEST: Bindungsstudien von Amyloid-beta an GroEL Protein (Probing the transient dark state of substrate binding to GroEL by relaxation-based solution NMR, D. S. Libich, N. L. Fawzi, J. Ying, G. M. Clore, Proceedings of the National Academy of Sciences 2013, 110, ) Weitere Untersuchungen von Beta-Amyloid: Nachweis von unterschiedlichen Konformationszustände (Getrennte Konformationszustände des Alzheimer-β-Amyloidpeptids Nachweis mit Hochdruck-NMR-Spektroskopie, C. E. Munte, M. Beck Erlach, W. Kremer, J. Koehler, H. R. Kalbitzer, Angew. Chem. 2013, 125, ) 13

15 Vielen Dank für die Aufmerksamkeit! 14

16 Quellen N. L. Fawzi, J. Ying, D. A. Torchia, G. M. Clore, J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, N. L. Fawzi, J. Ying, R. Ghirlando, D. A. Torchia, G. M. Clore, Nature 2011, 480, N. L. Fawzi, J. Ying, D. A. Torchia, G. M. Clore, Nat Protoc 2012, 7, H. A. Scheidt, I. Morgado, S. Rothemund, D. Huster, M. Fändrich, Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50,